4. Nội dung nghiên cứu
3.5.4. Kết quả xác định thời gian và nhiệt độ lên men trong quytrìn hủ chua bã sắn
Tiến hành lên men bã sắn tƣơi ở các nhiệt độ khác nhau 24 ± 2 oC, 30 ± 2 oC và 36 ± 2 o
C trong khoảng thời gian 24 h ÷ 120 h để xác định nhiệt độ, thời gian lên men thích hợp tạo điều kiện cho vi khuẩn hoạt động nhằm khử cyanua cao nhất đáp ứng đƣợc chỉ tiêu về an toàn cho phép đối với gia súc khi làm thức ăn chăn nuôi và rút ngắn quá trình ủ. Kết quả đƣợc chỉ ra ở Hình 3.17, Hình 3.18 và Hình 3.19 cho thấy hàm lƣợng cyanua tổng số, cyanua tự do đều giảm dần theo sự tăng của thời gian và nhiệt độ.
Ở 24 ± 2 o
C, hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do giảm dần theo thời gian lên men. Từ 24 h đến 48 h lên men thì hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do giảm chậm, sau 96 h lên men thì hàm lƣợng cyanua tổng số giảm mạnh hơn 109,5 ± 5,1 mg/kg khối lƣợng chất khô nhƣng vẫn vƣợt quá 100 mg/kg khối lƣợng chất khô. Quá trình lên men này kéo dài đến 120 h thì hàm lƣợng cyanua tổng số giảm xuống 87,3 ± 3,8 mg/kg khối lƣợng chất khô. Nhƣ vậy, ở nhiệt độ 24 ± 2 oC thì thời gian lên men kéo dài đến 120 h (5 ngày) hàm lƣợng cyanua tổng mới đạt đến mức cho phép, điều đó có nghĩa là nhiệt độ thấp thì khả năng sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic chậm do đó hạn chế khả năng giải độc cynua trong bã sắn.
Ở 30 ± 2 oC, hàm lƣợng cyanua tổng số giảm dần trong suốt quá trình lên men từ 241,4 ± 8,60 mg/kg đến 60,7 ± 7,46 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 75%, Hình 3.18). Hàm lƣợng cyanua tự do giảm từ 120 ± 2,81 đến 26,23 ± 0,26 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 78%).
Hình 3.17: Kết quả xác định thời gian lên men bã sắn tƣơi ở nhiệt độ 24 ± 2 o
C
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu)
Hình 3.18: Kết quả xác định thời gian lên men bã sắn tƣơi ở nhiệt độ 30 ± 2 o
C
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu)
Hình 3.19: Kết quả xác định thời gian lên men ở nhiệt độ 36 ± 2 o
C trong quy trình ủ chua bã sắn tƣơi
Hàm lƣợng cyanua tổng số và hàm lƣợng cyanua tự do giảm nhẹ trong 48 h đầu tiên, và giảm mạnh sau 72 h hàm lƣợng cyanua tổng số là 74,9 ± 4,5 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 69%). Sau 72 h hàm lƣợng cyanua giảm không đáng kể. Nhƣ vậy, ở 30 ± 2 oC thì khả năng khử cyanua tốt hơn so với 24 ± 2 oC và thời gian lên men ngắn hơn. Điều này có thể đƣợc giải thích là do nhiệt độ lên men thích hợp với nhiệt độ hoạt động của vi sinh vật là tăng khả năng tăng sinh khối sinh ra acid lactic mạnh đồng thời thời gian kéo dài tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh enzyme để cắt đứt liên kết β và chuyển hóa chúng. Tuy nhiên nếu thời gian kéo dài thì khả năng khử cyanua giảm do vi khuẩn bƣớc vào giai đoạn suy thoái.
Ở 36 ± 2 o
C (Hình 3.19), hàm lƣợng cyanua tổng số giảm nhanh trong 24 h đầu tiên, 151 ± 5,7 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 37%) và hàm lƣợng cyanua tự do dƣới 100 mg/kg khối lƣợng chất khô. Sau 48 h lên men hàm lƣợng cyanua tổng số 96 ± 3,5 mg/kg khối lƣợng chất khô, đến 120 h thì khả năng khử cyanua tổng lên đến 80%. Nhƣ vậy, ở nhiệt độ cao thì kích thích sự phát triển của vi khuẩn càng nhanh nhƣng nếu thời gian lên men kéo dài thì hàm lƣợng acid càng cao ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phầm đồng thời tiêu tốn nhiều thời gian nên không có tính hiệu quả cao. Ở nhiệt độ này thì thời gian lên men đƣợc lựa chọn là 48 h lên men.
Nhƣ vậy, qua kết quả xác định thời gian lên men ở các nhiệt độ khác nhau cho thấy rằng ở nhiệt độ càng cao và thời gian lên men càng dài thì khả năng khử cyanua càng nhanh giảm xuống dƣới mức cho phép (100 mg/kg khối lƣợng chất khô). Ở các nhiệt độ khác nhau thì khả năng khử cyanua của chủng LB2 khác nhau và tăng dần theo độ tăng của nhiệt độ. Nhƣ vậy, với kết quả này cho phép chúng ta lựa chọn thời gian và nhiệt độ thích hợp khi thời tiết thay đổi khác nhau. Đối với mùa đông ta có thể lựa chọn thời gian lên men ít nhất 120 h (5 ngày), mùa hè có thể lựa chọn thời gian lên men ít nhất là 48 h (hai ngày). Trong nghiên cứu này, lựa chọn nhiệt độ ở 30 ± 2 o
C để tiến hành quá trình tối ƣu hóa.
3.6. Kết quả tối ƣu hóa quá trình ủ chua bã sắn tƣơi sử dụng chế phẩm lactic LB2
Chế phẩm lactic LB2 (mật độ tế bào là ≥ 2,6 x 108 CFU/g) đƣợc sử dụng trong quá trình tối ƣu hóa. Sự ảnh hƣởng của các yếu tố thời gian lên men (X1, giờ), hàm lƣợng rỉ đƣờng (X2, % w/w), mật độ tế bào chế phẩm lactic LB2 (X3, CFU/g) lên quá trình lên men đƣợc xác định bằng cách sử dụng phần mền Box–Behneken. Các giá trị
của hàm mục tiêu (hàm lƣợng cyanua tổng) trong quá trình lên men cùng với các biến độc lập đƣợc chỉ ra ở Bảng 3.5.
Bảng 3.5: Hàm mục tiêu (cyanua tổng số) trong quá trình tối ƣu hóa với sự kết hợp của các biến độc lập đối với bã sắn tƣơi lên men
STT Thời gian lên men (Giờ) Hàm lƣợng rỉ đƣờng % (w/w) Mật độ vi khuẩn lactic (CFU/g) Hàm lƣợng cyanua tổng số (mg/kg) 1 48 15 5,05 x 106 101,2 2 96 10 105 93,9 3 72 15 107 80,9 4 96 5 5,05 x 106 79,99 5 48 5 5,05 x 106 169,55 6 72 10 5,05 x 106 73,9 7 48 10 107 102,72 8 96 10 107 79,5 9 72 5 105 171,23 10 72 10 5,05 x 106 71,65 11 96 15 5,05 x 106 69,99 12 48 10 105 191,35 13 72 15 107 69,1 14 72 10 5,05 x 106 72,6 15 72 15 105 105,4
Mô hình đƣợc phân tích thống kê để giữ lại các hệ số có ý nghĩa (p < 0,05). Phƣơng trình hồi quy thể hiện mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng cyanua tổng số với ba biến:
Y1 = 72,72 – 30,17 X1 – 19,5 X2 – 28,72 X3 + 14,59 X1X2 + 18,54 X1X3
Bảng 3.6: Bảng ANOVA thể hiện hàm lƣợng cyanua tổng số chịu ảnh hƣởng bởi thời gian lên men, hàm lƣợng rỉ đƣờng và mật độ vi khuẩn lactic trong
suốt quá trình ủ chua bã sắn tƣơi
Theo ANOVA của hàm lƣợng cyanua tổng số đƣợc trình bày ở Bảng 3.6. Mô hình thu đƣợc có ý nghĩa với F-testcyanua (p < 0,0001). Giá trị lack of fitcyanua” cho mô hình hồi quy bậc hai là không có ý nghĩa (pcyanua = 0,0529 > 0,05), chỉ ra rằng việc dự đoán hiệu quả của quá trình lên men khử cyanua tổng số là thích hợp dƣới bất kỳ sự tƣơng tác của nhân tố nào. Hệ số tƣơng quan bội R2
cyanua = 0,997 cho thấy giữa giá trị thực nghiệm và giá trị tiên đoán có mối tƣơng quan tốt, đồng thời cũng ngụ ý rằng mô hình toán học rất đáng tin cậy cho sự khử cyanua tổng số trong quá trình lên men lactic sử dụng chế phẩm lactic LB2. Giá trị Pred-R2cyanua = 0,9527 gần với giá trị Adj-R2cyanua = 0,9915 cho biết mô hình dự đoán là hợp lý để xây dựng quy trình ủ chua bã sắn làm Nguồn Tổng bình phƣơng Bậc tự do Trung bình bình phƣơng F P-value (prob> F) Model 23462,76 9 2606,97 180,44 < 0,0001 significant Intercept 1 X1 7286,66 1 7286,66 504,35 < 0,0001 X2 3041,22 1 3041,22 210,50 < 0,0001 X3 6592,96 1 6592,96 456,34 < 0,0001 X1X2 851,18 1 851,18 58,92 0,0006 X1X3 1377,52 1 1377,52 95,35 0,0002 X2X3 729,81 1 729,81 50,51 0,0009 X12 1681,13 1 1681,13 116,36 0,0001 X22 457,22 1 457,22 31,65 0,0025 X32 1921,58 1 1921,58 133,00 < 0,0001 Residual 72,2448,32 5 14,45
Lack of fit 69,69 3 23,23 18,21 0,0525 Not significant R2 0,997 Adj-R2 0,9915 Pred-R2 0,9527 Adeq- Precision 40,169
giảm hàm lƣợng cyanua tổng số. Các biến độc lập thời gian lên men, hàm lƣợng rỉ đƣờng và mật độ vi khuẩn lactic LB2 cũng nhƣ sự tƣơng tác giữa các yếu tố này có tác động có ý nghĩa đến quá trình khử cyanua tổng số trong quá trình lên men (p < 0,0001). Đồ thị áp ứng bề mặt 3D của hàm lƣợng cyanua tổng số với mật độ vi khuẩn lactic là 5,05 x 106
CFU/g là một hàm của thời gian lên men và hàm lƣợng rỉ đƣờng đƣợc trình bày ở Hình 3.20. Kết quả chỉ ra rằng hàm lƣợng cyanua tổng số giảm không đáng kể khi hàm lƣợng rỉ đƣờng vƣợt quá 10% và dần đến 15%, điều này có thể giải thích do sự ức chế quá trình lên men bởi sự dƣ thừa cơ chất. Thời gian lên men giảm nhanh từ 48 h đến 72 h và giảm dần dần khi thời gian lên men kéo dài.
Sự tƣơng tác giữa thời gian lên men và mật độ vi khuẩn lactic khi hàm lƣợng rỉ đƣờng 10% đƣợc thể hiện trên hình 3D (Hình 3.21). Những con số này cho thấy sự khử cyanua tổng số giảm mạnh theo sự gia tăng mật độ vi khuẩn lactic và thời gian lên men. Tuy nhiên, sự giảm cyanua tổng số không đáng kể khi mật độ vi khuẩn lactic lớn hơn 5,05 x 106
CFU/g và thời gian lên men càng kéo dài thì hàm lƣợng cyanua tổng số càng giảm do thời gian dài là điều kiện cho vi khuẩn lactic sinh enzyme linamarase để thủy phân hợp chất cyanua ở dạng liên kết và chuyển hóa cyanua ở dạng tự do. Sự tƣơng tác giữa mật độ vi khuẩn lactic và hàm lƣợng rỉ đƣờng cũng đƣợc thể hiện ở Hình 3.22. Mật độ vi khuẩn lactic càng cao thì sẽ có sự canh tranh cơ chất mạnh mẽ hơn nhƣng đồng thời cũng làm giảm khả năng phát triển đến giai đoạn mạnh nhất nên hàm lƣợng cyanua tổng số giảm không lớn khi mật độ vi khuẩn quá lớn so với hàm lƣợng rỉ đƣờng.
Hình 3.20: Mô hình đáp ừng bề mặt 3D về ảnh hƣởng của thời gian lên men và hàm lƣợng rỉ đƣờng, lên hàm
lƣợng cyanua tổng số
Hình 3.21: Mô hình đáp ừng bề mặt 3D về ảnh hƣởng của hàm lƣợng rỉ
đƣờng, mật độ vi khuẩn lactic lên hàm lƣợng cyanua tổng số
Hình 3.22: Mô hình đáp ừng bề mặt 3D vể ảnh hƣởng của thời gian lên men và mật độ vi khuẩn lactic lên hàm lƣợng cyanua tổng số
Để xác định mức độ tối ƣu hóa của các biến (X1, X2, X3) thì hàm mục tiêu mong muốn đạt đến hàm lƣợng cyanua tổng < 100 mg/kg khối lƣợng chất khô. Tối ƣu hoá hàm đa mục tiêu, hai hàm mục tiêu đƣợc kết hợp trên cùng các thông số kỹ thuật và ở trong khoảng đã chọn và kết quả xử lý bằng phần mềm Design-Expert 8.0.2, đã đƣa ra 5 giải pháp tối ƣu hoá, thể hiện ở Phụ lục 23. Tuy nhiên, ta lựa chọn giải pháp tối ƣu hoá có mức độ mong muốn cao hơn (0,959) kết hợp thời gian lên men ngắn, hàm lƣợng rỉ đƣờng và mật độ vi khuẩn lactic thấp để đảm bảo tính kinh tế cao. Do đó các yếu tố tối ƣu để đạt đƣợc mục tiêu trên là 71,37 h lên men, hàm lƣợng rỉ đƣờng 7,75% và mật độ vi khuẩn lactic 3,37 x 106
CFU/g, lúc này hàm lƣợng cyanua tổng số là 90 mg/kg khối lƣợng chất khô. (Hình 3.23)
Hình 3.23: Giá trị tối ƣu hóa theo dự đoán
Ham luong cyanua 90.0002 X1 71.37 X2 7.75
Khả năng dự đoán của mô hình tối ƣu đƣợc đánh giá bằng cách so sánh các giá trị tiên đoán và giá trị thực nghiệm. Ta tiến hành thí nghiệm kiểm chứng, mỗi thí nghiệm kiểm chứng đƣợc lặp lại 3 lần, các thí nghiệm kiểm chứng đƣợc tiến hành xoay quanh giá trị tối ƣu hoá mà phần mềm đã đƣa ra và nằm trong vùng tối ƣu hoá dự đoán. Kết quả thí nghiệm kiểm chứng thu đƣợc nhƣ trên Bảng 3.7.
Bảng 3.7: Kết quả thí nghiệm kiểm chứng và kết quả tiên đoán
Từ kết quả Bảng 3.7. cho thấy rằng kết quả thí nghiệm kiểm chứng hàm lƣợng cyanua tổng số là 95 mg/kg khối lƣợng chất khô cao hơn giá trị tiên đoán 90 mg/kg khối lƣợng chất khô. Do đó mô hình tối ƣu hóa là tƣơng đối chính xác.
3.7. Đề xuất quy trình ủ chua bã sắn tƣơi sử dụng chế phẩm lactic LB2
3.7.1. Quy trình ủ chua bã sắn tươi
Quy trình ủ chua bã sắn tƣơi sử dụng chế phẩm lactic LB2 đƣợc trình bày ở Hình 3.24.
Hình 3.24: Sơ đồ quy trình ủ chua bã sắn tƣơi sử dụng chế phẩm lactic LB2
Thời gian lên men (Giờ) Hàm lƣợng rỉ đƣờng % (w/w) Mật độ vi khuẩn lactic (CFU/g) Hàm lƣợng cyanua tổng số (mg/kg khối lƣợng khô) Giá trị tiên đoán 71,37 7,75 3,37 x 106 90
Giá trị thực nghiệm 71,37 7,75 3,37 x 106 95
Sản phẩm bã sắn lên men dùng trong chăn nuôi Bã sắn tƣơi Lên men ح = 72 h To = 30 ± 2 oC pH tự nhiên NaCl 0,5% (w/w) Rỉ đƣờng 7,75% (w/w) Chế phẩm (mật độ vi khuẩn lactic ≥ 2,6x 108 CFU/g): 1,3% (w/w)
3.7.2. Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu:
Bã sắn tƣơi đƣợc thu mua từ nhà máy chế biến sắn.
Rỉ đƣờng: đƣợc hấp 121 oC trong 15 phút để tránh nhiễm tạp.
Công đoạn lên men
Mục đích: ủ chua bã sắn tƣơi nhằm khử hàm lƣợng cyanua tổng xuống dƣới mức cho phép < 100 mg/kg khối lƣợng chất khô để sử dụng làm thức ăn cho gia súc. Tiến hành: bã sắn tƣơi đƣợc ủ kín với NaCl 0,5% (w/w), rỉ đƣờng 7,75% (w/w), chế phẩm (mật độ vi khuẩn lactic ≥ 2,6 x 108 CFU/g) 1,3% (w/w) ở nhiệt độ 30 ± 2 oC trong thời gian 72 h (3 ngày). Sau đó, sản phẩm đƣợc sử dụng làm thức ăn chăn nuôi.
3.8. Xác định hàm lƣợng cyanua bay hơi trong quá trình lên men:
Kết quả xác định hàm lƣợng cyanua trong quá trình lên men theo các thông số đã tối ƣu là 5,97 ± 0,12 mg/kg khối lƣợng chất khô, bằng 0,043% hàm lƣợng cyanua tổng đƣợc khử trong quá trình lên men. Chứng tỏ lƣợng cyanua bay hơi trong quá trình lên men là không đáng kể, ít ảnh hƣởng đến môi trƣờng và con ngƣời xung quanh. Tuy nhiên, cần có hệ thống hút khí cho khu vực ủ bã sắn, nhất là khi tiến hành ủ chua bã sắn với số lƣợng lớn.
3.9. Kết quả xác định các thông số xây dựng quy trình ủ chua bã sắn khô sử
dụng chế phẩm lactic LB2
3.9.1. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng khử cyanua của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men trình lên men
Hình 3.25: Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng khử cyanua tổngsố của vi khuẩn lactic
Tiến hành lên men có bổ sung bột đậu nành 5% (w/w), NaCl 0,5% (w/w), chế phẩm lactic (mật độ vi khuẩn lactic 106 CFU/g) vào bã sắn khô, bổ sung thêm nƣớc với các tỉ lệ khác nhau, tiến hành xác định độ ẩm và xác định hàm lƣợng cyanua tổng số còn lại trong bã sắn sau 48 h lên men. Kết quả đƣợc thể hiện trên Hình 3.25.
Dựa vào đồ thị ta thấy rằng hàm lƣợng cyanua tổng số cao nhất khi hàm lƣợng ẩm của bã sắn là 53% ứng với tỷ lệ (BSK+ĐN) : nƣớc là 1:1 và giảm dần khi hàm lƣợng ẩm tăng đến 82% ứng với tỷ lệ (BSK+ĐN) là 1:3,5. Ở độ ẩm 74% (1:2,5), 78% (1:3) và 82 % (1:3,5) thì hàm lƣợng cyanua tổng số không chênh lệch đáng kể. Nhƣ vậy, độ ẩm từ 74% trở lên thì vi khuẩn lactic phát triển tốt có khả năng khử cyanua tổng tốt (giảm 49%).
Kết luận: ta có thể chọn độ ẩm cho quá trình lên men bã sắn nằm trong khoảng này, tuy nhiên để tiết kiệm nước ta lựa chọn hàm lượng ẩm là 74% để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
3.9.2. Kết quả xác định chất bổ sung trong quy trình ủ chua bã sắn khô
Bã sắn khô đƣợc trộn với bột đậu nành 5% (w/w), NaCl 0,5% (w/w) và chế phẩm lactic (mật độ vi khuẩn lactic 106 CFU/g) phối trộn hỗn hợp này với nƣớc theo tỉ lệ 1:2,5 (ẩm 74%), sau đó tiến hành thí nghiệm 2.3.5.2. Kết quả đƣợc chỉ ra ở Hình 3.26.
Hình 3.26: Kết quả xác định chất bổ sung thích hợp trong quy trình ủ chua bã sắn khô
Nhìn vào đồ thị ta thấy, khi bổ sung các chất cám gạo và rỉ đƣờng vào quá trình lên men thì hàm lƣợng cyanua tổng và hàm lƣợng cyanua tự do giảm so với quá trình lên men bã sắn chỉ với chế phẩm lactic và bột đậu nành. Cụ thể, hàm lƣợng cyanua tổng trong nguyên liệu ban đầu là 78 ± 5,2 mg/kg khối lƣợng chất khô, bã sắn ủ với đậu nành hàm lƣợng cyanua tổng giảm là 40 ± 2,3 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 48%). Bã sắn ủ với bột đậu nành và cám gạo, hàm lƣợng cyanua tổng giảm xuống là 33 ± 2,6 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 57%). Bã sắn ủ với bột đậu nành