4. Nội dung nghiên cứu
3.4.2.xuất quytrình sản xuất chế phẩm lactic LB2 theo các thông số đã lựa chọn.
Quy trình sản xuất chế phẩm lactic LB2 đƣợc tóm tắt ở sơ đồ Hình 3.13
Hình 3.13: Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm lactic LB2
3.4.2.2. Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu: Bã sắn khô đƣợc nghiền nhỏ, độ ẩm < 14 %. [12] Đậu nành có độ ẩm 10 ÷ 14%. [12] Hàm lƣợng vi khuẩn lactic 10% (v/w) Kiểm tra mật độ vi khuẩn lactic LB2 Hàm lƣợng ẩm 74% Lactobacillus plantarum Nhân giống cấp1 (MRS, 48 h, 30 ± 2 oC) Đậu nành/bã sắn (3/7) ح = 48 h To= 30 ± 2 oC pH tự nhiên Trộn với chất mang (bột đậu nành) Nhân giống cấp 2 Bao gói Hút chân không (80%) Bảo quản Chế phẩm lactic LB2 Sấy lạnh
Nhân giống cấp 1:
Mục đích: tăng sinh khối tế bào cho quá trình nhân giống cấp 2 và xác định mật độ vi khuẩn lactic.
Tiến hành: chủng Lactobacillus plantarum đƣợc nuôi cấy trong 100 ml môi trƣờng MRS trong 24 h ở 30 ± 2 o
C. Sau đó, định lƣợng mật độ vi khuẩn lactic và tiến hành nhân giống cấp 2 trên môi trƣờng bã sắn.
Nhân giống cấp 2:
Mục đích: tạo ra chế phẩm lactic LB2 tốt có mật độ tế bào lớn nhất, có tính ổn định, phát triển tốt trên môi trƣờng bã sắn và chủng này có khả năng lên men tốt bã sắn nhằm khử đƣợc hàm lƣợng cyanua tổng đến mức thấp nhất.
Tiến hành: 50 g đậu nành sau khi đƣợc ngâm, bóc vỏ và xay sẽ đem đi phối trộn với bã sắn ở tỉ lệ là 3/7. Sau đó bổ sung nƣớc vào hỗn hợp này với tỉ lệ (đậu nành/bã sắn) : nƣớc là 2,5:1 và 10% (v/w) hàm lƣợng vi khuẩn Lactobacillus plantarum đã đƣợc nhân giống cấp 1. Tiến hành nhân giống trong 48 h ở 30 ± 2 o
C, pH tự nhiên.
Sấy lạnh:
Mục đích: tạo tính ổn định cho chế phẩm và bảo quản dễ dàng.
Tiến hành: sau khi nhân giống cấp 2, bán thành phẩm sẽ đƣợc tiến hành sấy lạnh ở nhiệt độ 30 oC trong thời gian 6 h.
Trộn với chất mang:
Mục đích: thuận lợi cho quá trình bảo quản, vận chuyển và sử dụng.
Tiến hành: chất mang đƣợc sử dụng ở đây là bột đậu nành đã sấy khô dƣới < 14%, sau đó đem xay bằng máy xay sinh tố, để nguội và tiếp tục sấy trong 3 giờ. Sau khi bán thành phẩm đƣợc sấy lạnh, sẽ đƣợc phối trộn với bột đậu nành theo tỉ lệ 1:2 thu đƣợc chế phẩm lactic LB2.
Bao gói, hút chân không:
Mục đích: kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm.
Tiến hành: chế phẩm lactic LB2 sẽ đƣợc bao gói trong bao PA, 100g/gói và hút chân không 80%.
Bảo quản:
Mục đích: bảo quản chế phẩm lactic LB2.
3.4.3. Chế độ bảo quản chế phẩm lactic LB2
Chế phẩm lactic LB2 sau khi đƣợc sản xuất theo quy trình ở 3.4.2 có mật độ vi khuẩn lactic là 3,5 x 108 CFU/g đƣợc tiến hành bảo quản lạnh ở 4 oC theo thời gian (Δ ح = 1 tuần). Kết quả bảo quản đƣợc trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4: Mật độ vi khuẩn lactic trong chế phẩm theo thời gian bảo quản
Thời gian bảo quản Mật độ vi khuẩn lactic LB2 (CFU/g) 1 tuần 3,5 x 108 2 tuần 3,3 x 108 3 tuần 3,0 x 108 4 tuần 2,8 x 108 5 tuần 2,8 x 108 6 tuần 2,7 x 108 7 tuần 2,6 x 108 8 tuần 2,6 x 108
Nhƣ vậy, qua 4 ÷ 8 tuần bảo quản chế phẩm lactic LB2 thì mật độ vi khuẩn lactic trong chế phẩm thay đổi không đáng kể so với mật độ ban đầu, điều đó chứng tỏ rằng chế phẩm lactic LB2 có tính ổn định cao. Do đó, chế phẩm lactic LB2 sau khi sản xuất đƣợc bảo quản lạnh để sử dụng trong thời hạn hai tháng.
3.5. Kết quả xác định các thông số xây dựng quy trình ủ chua bã sắn tƣơi sử
dụng chế phẩm lactic LB2
3.5.1. Kết quả xác định chất bổ sung trong quy trình ủ chua bã sắn tươi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chế phẩm lactic (mật độ ≥ 2,6 x 108 CFU/g) đƣợc bổ sung vào bã sắn tƣơi cùng với 5% (w/w) các chất bổ sung lên men trong 72 h đƣợc chỉ ra ở Hình 3.14. Nhìn vào đồ thị ta thấy, khi bổ sung các chất cám gạo, bột đậu nành và rỉ đƣờng vào quá trình lên men thì hàm lƣợng cyanua tổng số và hàm lƣợng cyanua tự do giảm đáng kể so với quá trình lên men bã sắn chỉ với chế phẩm lactic.
Cụ thể, hàm lƣợng cyanua tổng số trong nguyên liệu ban đầu là 241 ± 5,8 mg/kg khối lƣợng chất khô, sau khỉ ủ không chất bổ sung và ủ với các chất bổ sung hàm lƣợng cyanua tổng số lần lƣợt là 195 ± 7,2 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 19%) và dao động 142 ± 3,26 đến 108 ± 4,26 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 41 ÷ 55%). Hàm
lƣợng cyanua tự do từ 120 ± 6,7 mg/kg khối lƣợng chất khô khi lên men bổ rỉ đƣờng giảm mạnh nhất đến 50 ± 3,5 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 59%), đối với cám gạo và bột đậu nành khả năng giảm cyanua tự do thấp hơn.
Hình 3.14: Kết quả xác định chất bổ sung thích hợp trong quy trình ủ chua bã sắn tƣơi
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu) Nhƣ vậy, rỉ đƣờng là chất có khả năng khử dạng liên kết của hợp chất cyanua (23%) và chuyển hóa cyanua tự do (32%) mạnh nhất. Nguyên nhân của sự thay đổi này là do trong rỉ đƣờng có hàm lƣợng đƣờng khử tƣơng đối cao, các loại đƣờng đơn glucose và fructose là nguồn cacbohydrat đơn giản dễ chuyển hóa giúp vi khuẩn lactic phát triển nhanh, rỉ đƣờng có hàm lƣợng cacbohydrat (16%) cao hơn trong bột đậu nành (8,5%), thấp hơn cám gạo (28%) nhƣng nguồn cacbohydrat trong cám gạo chủ yếu là tinh bột mà vi khuẩn lactic khó sử dụng nên hiệu quả khử cyanua khi sử dụng cám gạo làm chất bổ sung kém hơn chất bổ sung là rỉ đƣờng. Ngoài ra rỉ đƣờng giàu khoáng và các nguyên tố vi lƣợng, đặc biệt là biotin kích thích vi khuẩn lactic hoạt động tăng cƣờng khả năng khử cyanua tổng.
Kết luận: trong thí nghiệm này, rỉ đường là chất bổ sung được lựa chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
3.5.2. Kết quả xác định hàm lượng rỉ đường trong quy trình ủ chua bã sắn tươi
Hình 3.15: Kết quả xác định hàm lƣợng rỉ đƣờng thích hợp trong quy trình ủ chua bã sắn tƣơi
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu) Kết quả xác định hàm lƣợng rỉ đƣờng bổ sung vào bã sắn tƣơi lên men đƣợc trình bày ở Hình 3.15. Dựa vào đồ thị ta thấy, hàm lƣợng cyanua tổng số và hàm lƣợng cyanua tự do có xu hƣớng giảm khi hàm lƣợng rỉ đƣờng tăng, giảm mạnh khi hàm lƣợng rỉ đƣờng ở 5%, hàm lƣợng cyanua tổng số là 109 ± 3,7 mg/kg khối lƣợng chất khô nhƣng vẫn trên giới hạn cho phép sử dụng làm thức ăn cho chăn nuôi (100 mg/kg khối lƣợng chất khô). Hàm lƣợng rỉ đƣờng ở 10% thì hàm lƣợng cyanua tổng số giảm còn 75 ± 5,9 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 69%), khả năng cắt đứt liên kết của hợp chất cyanua là 67%, khả năng chuyển hóa cyanua tự do là 71%; và giảm nhẹ khi hàm lƣợng rỉ đƣờng tăng lên 20%. Hàm lƣợng cyanua tự do khi lên men ở bất cứ hàm lƣợng nào đều giảm đến mức cho phép. Do đó, cần bổ sung thêm rỉ đƣờng để cung cấp cơ chất cho quá trình lên men, tuy nhiên hàm lƣợng rỉ đƣờng quá cao sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn lactic hạn chế khả năng khử cyanua của vi khuẩn lactic.
Kết luận: qua kết quả khảo sát ta chọn hàm lượng rỉ đường cho quá trình tối ưu công đoạn lên men là 5% đến 15%. Để đảm bảo tính kinh tế thì hàm lượng rỉ đường 10% được chọn để thực hiện các thí nghiệm thăm dò tiếp theo.
3.5.3. Kết quả xác định mật độ vi khuẩn lactic LB2 trong quy trình ủ chua bã sắn tươi
Hình 3.16: Kết quả xác định mật độ vi khuẩn lactic LB2 thích hợp trong quy trình ủ chua bã sắn tƣơi
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu) Kết quả xác định mật độ vi khuẩn lactic LB2 bổ sung vào quá trình lên men đƣợc chỉ ra ở Hình 3.16. Kết quả chỉ ra rằng, so với nguyên liệu ban đầu ở mật độ vi khuẩn lactic 104 CFU/g, hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do còn lại trong bã sắn sau lên men lớn nhất 172 ± 5,1 mg/kg (giảm 30%) và 78,9 ± 5,55 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 34%). Ở mật độ vi khuẩn lactic 107
CFU/g, hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do là thấp nhất là 67 ± 3,2 mg/kg (giảm 72%), 33,6 ± 6,13 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 72%). Tuy nhiên giữa mật độ vi khuẩn lactic 106 CFU/g và 107 CFU/g thì hàm lƣợng cyanua tổng số không có sự khác nhau về ý nghĩa thống kê. Khi tăng mật độ vi khuẩn lactic lên 108
CFU/g thì hàm lƣợng cyanua lớn hơn so với mật độ 107 CFU/g. Nhƣ vậy, ở mật độ vi khuẩn lactic 106 CFU/g, 107 CFU/g, 108
CFU/g thì hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do đều dƣới ngƣỡng cho phép (100 mg/kg khối lƣợng chất khô).
Để tăng khả năng khử cyanua trong quá trình lên men cần bổ sung chế phẩm lactic với mật độ vi khuẩn phù hợp, tuy nhiên việc bổ sung lƣợng chế phẩm lactic thích hợp cần có sự cân nhắc và chú ý đến tính kinh tế. Khi bổ sung lƣợng chế phẩm lactic với mật độ vi khuẩn quá thấp thì khả năng khử cyanua kém nên sản phẩm sau quá trình lên men không đạt về chất lƣợng cũng nhƣ sự ƣa thích mùi vị đối với gia súc.
Kết luận: qua kết quả khảo sát ta chọn mật độ vi khuẩn lactic LB2 trong chế phẩm cho quá trình tối ưu công đoạn lên men là 105 CFU/g đến 107 CFU/g. Tỉ lệ chế phẩm lactic thích hợp 106 CFU/g để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
3.5.4. Kết quả xác định thời gian và nhiệt độ lên men trong quy trình ủ chua bã sắn tươi
Tiến hành lên men bã sắn tƣơi ở các nhiệt độ khác nhau 24 ± 2 oC, 30 ± 2 oC và 36 ± 2 o
C trong khoảng thời gian 24 h ÷ 120 h để xác định nhiệt độ, thời gian lên men thích hợp tạo điều kiện cho vi khuẩn hoạt động nhằm khử cyanua cao nhất đáp ứng đƣợc chỉ tiêu về an toàn cho phép đối với gia súc khi làm thức ăn chăn nuôi và rút ngắn quá trình ủ. Kết quả đƣợc chỉ ra ở Hình 3.17, Hình 3.18 và Hình 3.19 cho thấy hàm lƣợng cyanua tổng số, cyanua tự do đều giảm dần theo sự tăng của thời gian và nhiệt độ.
Ở 24 ± 2 o
C, hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do giảm dần theo thời gian lên men. Từ 24 h đến 48 h lên men thì hàm lƣợng cyanua tổng số và cyanua tự do giảm chậm, sau 96 h lên men thì hàm lƣợng cyanua tổng số giảm mạnh hơn 109,5 ± 5,1 mg/kg khối lƣợng chất khô nhƣng vẫn vƣợt quá 100 mg/kg khối lƣợng chất khô. Quá trình lên men này kéo dài đến 120 h thì hàm lƣợng cyanua tổng số giảm xuống 87,3 ± 3,8 mg/kg khối lƣợng chất khô. Nhƣ vậy, ở nhiệt độ 24 ± 2 oC thì thời gian lên men kéo dài đến 120 h (5 ngày) hàm lƣợng cyanua tổng mới đạt đến mức cho phép, điều đó có nghĩa là nhiệt độ thấp thì khả năng sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic chậm do đó hạn chế khả năng giải độc cynua trong bã sắn.
Ở 30 ± 2 oC, hàm lƣợng cyanua tổng số giảm dần trong suốt quá trình lên men từ 241,4 ± 8,60 mg/kg đến 60,7 ± 7,46 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 75%, Hình 3.18). Hàm lƣợng cyanua tự do giảm từ 120 ± 2,81 đến 26,23 ± 0,26 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 78%).
Hình 3.17: Kết quả xác định thời gian lên men bã sắn tƣơi ở nhiệt độ 24 ± 2 o
C
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu)
Hình 3.18: Kết quả xác định thời gian lên men bã sắn tƣơi ở nhiệt độ 30 ± 2 o
C
(Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.19: Kết quả xác định thời gian lên men ở nhiệt độ 36 ± 2 o
C trong quy trình ủ chua bã sắn tƣơi
Hàm lƣợng cyanua tổng số và hàm lƣợng cyanua tự do giảm nhẹ trong 48 h đầu tiên, và giảm mạnh sau 72 h hàm lƣợng cyanua tổng số là 74,9 ± 4,5 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 69%). Sau 72 h hàm lƣợng cyanua giảm không đáng kể. Nhƣ vậy, ở 30 ± 2 oC thì khả năng khử cyanua tốt hơn so với 24 ± 2 oC và thời gian lên men ngắn hơn. Điều này có thể đƣợc giải thích là do nhiệt độ lên men thích hợp với nhiệt độ hoạt động của vi sinh vật là tăng khả năng tăng sinh khối sinh ra acid lactic mạnh đồng thời thời gian kéo dài tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh enzyme để cắt đứt liên kết β và chuyển hóa chúng. Tuy nhiên nếu thời gian kéo dài thì khả năng khử cyanua giảm do vi khuẩn bƣớc vào giai đoạn suy thoái.
Ở 36 ± 2 o
C (Hình 3.19), hàm lƣợng cyanua tổng số giảm nhanh trong 24 h đầu tiên, 151 ± 5,7 mg/kg khối lƣợng chất khô (giảm 37%) và hàm lƣợng cyanua tự do dƣới 100 mg/kg khối lƣợng chất khô. Sau 48 h lên men hàm lƣợng cyanua tổng số 96 ± 3,5 mg/kg khối lƣợng chất khô, đến 120 h thì khả năng khử cyanua tổng lên đến 80%. Nhƣ vậy, ở nhiệt độ cao thì kích thích sự phát triển của vi khuẩn càng nhanh nhƣng nếu thời gian lên men kéo dài thì hàm lƣợng acid càng cao ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phầm đồng thời tiêu tốn nhiều thời gian nên không có tính hiệu quả cao. Ở nhiệt độ này thì thời gian lên men đƣợc lựa chọn là 48 h lên men.
Nhƣ vậy, qua kết quả xác định thời gian lên men ở các nhiệt độ khác nhau cho thấy rằng ở nhiệt độ càng cao và thời gian lên men càng dài thì khả năng khử cyanua càng nhanh giảm xuống dƣới mức cho phép (100 mg/kg khối lƣợng chất khô). Ở các nhiệt độ khác nhau thì khả năng khử cyanua của chủng LB2 khác nhau và tăng dần theo độ tăng của nhiệt độ. Nhƣ vậy, với kết quả này cho phép chúng ta lựa chọn thời gian và nhiệt độ thích hợp khi thời tiết thay đổi khác nhau. Đối với mùa đông ta có thể lựa chọn thời gian lên men ít nhất 120 h (5 ngày), mùa hè có thể lựa chọn thời gian lên men ít nhất là 48 h (hai ngày). Trong nghiên cứu này, lựa chọn nhiệt độ ở 30 ± 2 o
C để tiến hành quá trình tối ƣu hóa.
3.6. Kết quả tối ƣu hóa quá trình ủ chua bã sắn tƣơi sử dụng chế phẩm lactic LB2
Chế phẩm lactic LB2 (mật độ tế bào là ≥ 2,6 x 108 CFU/g) đƣợc sử dụng trong quá trình tối ƣu hóa. Sự ảnh hƣởng của các yếu tố thời gian lên men (X1, giờ), hàm lƣợng rỉ đƣờng (X2, % w/w), mật độ tế bào chế phẩm lactic LB2 (X3, CFU/g) lên quá trình lên men đƣợc xác định bằng cách sử dụng phần mền Box–Behneken. Các giá trị
của hàm mục tiêu (hàm lƣợng cyanua tổng) trong quá trình lên men cùng với các biến độc lập đƣợc chỉ ra ở Bảng 3.5.
Bảng 3.5: Hàm mục tiêu (cyanua tổng số) trong quá trình tối ƣu hóa với sự kết hợp của các biến độc lập đối với bã sắn tƣơi lên men
STT Thời gian lên men (Giờ) Hàm lƣợng rỉ đƣờng % (w/w) Mật độ vi khuẩn lactic (CFU/g) Hàm lƣợng cyanua tổng số (mg/kg) 1 48 15 5,05 x 106 101,2 2 96 10 105 93,9 3 72 15 107 80,9 4 96 5 5,05 x 106 79,99 5 48 5 5,05 x 106 169,55 6 72 10 5,05 x 106 73,9 7 48 10 107 102,72 8 96 10 107 79,5 9 72 5 105 171,23 10 72 10 5,05 x 106 71,65 11 96 15 5,05 x 106 69,99 12 48 10 105 191,35 13 72 15 107 69,1 14 72 10 5,05 x 106 72,6 15 72 15 105 105,4
Mô hình đƣợc phân tích thống kê để giữ lại các hệ số có ý nghĩa (p < 0,05). Phƣơng trình hồi quy thể hiện mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng cyanua tổng số với ba biến:
Y1 = 72,72 – 30,17 X1 – 19,5 X2 – 28,72 X3 + 14,59 X1X2 + 18,54 X1X3
Bảng 3.6: Bảng ANOVA thể hiện hàm lƣợng cyanua tổng số chịu ảnh hƣởng bởi thời gian lên men, hàm lƣợng rỉ đƣờng và mật độ vi khuẩn lactic trong
suốt quá trình ủ chua bã sắn tƣơi
Theo ANOVA của hàm lƣợng cyanua tổng số đƣợc trình bày ở Bảng 3.6. Mô hình thu đƣợc có ý nghĩa với F-testcyanua (p < 0,0001). Giá trị lack of fitcyanua” cho mô hình hồi quy bậc hai là không có ý nghĩa (pcyanua = 0,0529 > 0,05), chỉ ra rằng việc dự đoán hiệu quả của quá trình lên men khử cyanua tổng số là thích hợp dƣới bất kỳ sự