4. Nội dung nghiên cứu
1.3.4. Con đường chuyển hóa linamarin và cyanua tổng của vi khuẩn lactic
Trong củ sắn chứa một lƣợng lớn độc tố của hai cyanogenic glucosides, linamarin 96% và lotaustrolin 4% [31]. Do đó, dựa vào quá trình lên men tự nhiên để loại bỏ hai độc tố này và quá trình bảo quản sản phẩm sắn cũng nhờ một lƣợng lớn acid lactic đƣợc tạo thành. Quá trình khử độc chủ yếu liên quan đến sự hiện diện của linamarase, β – glucosidase nội sinh, đƣợc giải phóng khi cấu trúc tế bào bị phá vỡ và cho phép thủy phân linamarin thành glucose và acetone cyanohydrin. Trong điều kiện một lƣợng enzyme giải phóng hay acid cao trong suốt quá trình lên men không cho phép quá trình giải độc linamarin hoàn toàn. [48], [78]
Sự tạo thành cyanua phụ thuộc vào giá trị của pH, nhiệt độ lên men, hoạt tính enzyme thủy phân. Hoạt tính của enzyme từ nguồn thực vật hay từ vi sinh vật đều có thể thủy phân lớn 95% linamarin trong vòng 3 h [64]. Một lƣợng đáng kể acetone
cyanohydrin và HCN tự do (43% lƣợng cyanua tổng/khối lƣợng chất khô sử dụng lên men) đƣợc loại bỏ sau khi lên men. Một số nghiên cứu khác cho thấy sau quá trình lên men truyền thống thì hàm lƣợng cyanogenic glucosides giảm từ 70 ÷ 75% do sự loại bỏ hợp chất cyanua nội sinh. [55], [76]
Liên kết β của linamarin có thể chỉ bị phá vỡ dƣới áp suất cao, nhiệt độ cao, acid vô cơ, và bị phá vỡ một cách dễ dàng bởi enzyme. Linamarase, một enzyme nội sinh có thể phá vỡ liên kết β và linamarase cũng đƣợc sinh ra bởi vi khuẩn lactic trên môi trƣờng bã sắn, đặc biệt là Leuconostoc mesenteroides và Lactococcus lactis. Bên cạnh đó, sự thủy phân cyanogenic glucosides diễn ra trong môi trƣờng acid (pH 3,8) trong suốt quá trình lên men lactic củ sắn, cũng nhƣ trong môi trƣờng kiềm (pH 8,5) trong lên men lá sắn cũng đã góp phần vào quá trình khử các hợp chất cyanua thành cyanua tự do. [55]
Một số công trình nghiên cứu khác chỉ ra rằng: các phản ứng enzyme xảy ra dƣới điều kiện thích hợp ở 25 o
C, pH từ 5,5 ÷ 6 [47]. Tại pH lớn hơn 5 aceton cyanohydrin sẽ tự phá vỡ tạo acetone và acid cyanhydric (HCN) dƣới tác dụng của enzyme hydroxynitrile lyase (HNL) có mặt trong sắn (Hình 1.8). [71]
Hình 1.8: Quá trình chuyển hóa linamarin. [71]
Tính kháng lại sự ức chế của cyanua lên vi khuẩn lactic yếu do vi khuẩn lactic chịu đƣợc nồng độ cyanua cao, trong khi đó đối với sự phát triển của các loại vi khuẩn khác nhƣ E. coli, hoàn toàn bị ức chế bởi nồng độ cyanua từ 2 ÷ 3 ppm. Tốc độ tăng trƣởng của vi khuẩn lactic bị ức chế khi nồng độ cyanua lên đến 1000 ppm. [55]
Acid cyanhydric
Vi sinh vật có thể phát triển trong chất nền có chứa cyaua do chuyển hóa kỵ khí của chúng, quá trình trao đổi chất luân phiên của chúng liên quan đến chuỗi hô hấp. [33]
Các loài vi sinh vật khác nhau có thể tạo ra acid cyanhydric hay làm giảm hàm lƣợng cyanua. Chúng làm giảm cyanua để giải độc cho cơ thể hoặc là sử dụng nó nhƣ là một nguồn nitơ cấn thiết cho sự tăng trƣởng. Một lƣợng lớn đáng kể cyanua hình thành là do quá trình trao đổi chất của các loại nấm và một số loại vi khuẩn bằng cách decacboxyl của glycine. Khi cyanua đƣợc hình thành bởi các loại nấm, quá trình giảm cyanua là do sự tạo carbon dioxide và ammonia. Ngƣợc lại, sự chuyển hóa cyanua của vi khuẩn không tạo ra sản phẩm dị hóa cyanua hoặc có thể chuyển nó thành beta- cyanoalanine bằng cách cộng vào cysteine hoặc O – acetylserine. [34], [52]
Vi khuẩn có thể sử dụng cyanua nhƣ là một nguồn nitơ cho sự phát triển của chúng. Do cyanua, nhƣ KCN hoặc NaCN, độc đối với vi khuẩn, tác động đến sự phát triển của vi khuẩn, vi khuẩn (Pseudomonas fluorescens) phải đƣợc phát triển trong canh cấy có bổ sung chất dinh dƣỡng với chất dinh dƣỡng giới hạn là cyanua. Cyanua đƣợc biến đổi thành CO2 và NH3 nhờ hệ enzyme cyanide oxygenase (sau đó NH3 đƣợc đồng hóa [34]. Điều đó có nghĩa là khả năng giải độc cyanua của chúng bằng cách tách gốc CN ¯ thành cacbon và nitơ. [53], [62]
Một số nghiên cứu cho thấy ở một số loài Pseudomonas có khả năng chuyển hóa cyanua thành formate và ammonia. [34]
Mặt khác, glucose giải phóng bởi quá trình thủy phân linamarin đƣợc chuyển hóa ngay lập tức thành acid lactic bởi vi khuẩn lactic [48]. Nhƣ vậy, các sản phẩm thủy phân linamatin đều đƣợc vi khuẩn lactic chuyển hóa sử dụng làm cơ chất cho sự sinh trƣởng phát triển trong quá trình lên men làm tăng khả năng giải độc và bảo quản tốt sản phẩm.
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về xử lý bằng vi sinh vật đối với
bã sắn dùng làm thức ăn chăn nuôi
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Sử dụng probiotic trong chăn nuôi đang đƣợc quan tâm. Nhiều sản phẩm có nguồn gốc nƣớc ngoài cho thấy có hiệu quả. Chế phẩm EM (vi sinh vật hữu hiệu) đƣợc sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi gia súc, gia cầm khác nhau. Sản phẩm Enteracide, một probiotic chứa Lactobacillus acidophilus và Streptococcus faecium
hệ thống tiêu hóa. Biomate 2B plus (B. licheniformis và B. subtilis) tăng hiệu quả thức ăn và tăng trƣởng của lợn con hơn là dùng chất kháng sinh. Lợn con ăn probiotic
Bacillus toyoi hoặc hỗn hợp Saccharomyces cerevisae, Lactobacillus acidophilus và
Streptococcus faecium làm tăng trọng lƣợng đáng kể so với việc dùng kháng sinh. Việc đƣợc sử dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi gia súc hiện nay chỉ nhằm cung cấp thêm chất xơ là chính, chƣa chú ý đến khai thác có hiệu quả các chất có trong bã sắn. [7]
Ở Việt Nam bã sắn chủ yếu sử dụng làm thức ăn gia súc trực tiếp, ủ chua hay phơi khô nhƣng chất lƣợng không cao. Tuy nhiên đã có nhiều công trình nghiên cứu:
Các tác giả Đặng Thị Thu (1995), Nguyễn Thị Xuân Sâm, Đặng Thị Thu (1996) và Lê Văn Hoàng (1998), có thử nghiệm các qui trình xử lý bã sắn bằng phƣơng pháp lên men vi sinh vật để ủ làm thức ăn gia súc với qui mô nhỏ ở phòng thí nghiệm. [7]
Nguyễn Thạc Hòa (1999), tiến hành thử nghiệm lên men trên môi trƣờng gồm bã sắn 75 ÷ 80%, cám gạo 15 ÷ 20% và các muối vô cơ bổ sung làm thức ăn gia súc.
Đặng Văn Lợi (2000), đã sử dụng chủng A.niger phân lập đƣợc từ bã sắn nhà máy sản xuất tinh bột để lên men bã sắn làm thức ăn cho gia súc. Sau 21 giờ lên men hàm lƣợng protein thô đạt 10,1% chất khô, sản phẩm không chứa độc tố aflatoxin.
Bùi Thị Quỳnh Vân (2000), nghiên cứu sử dụng tổ hợp các vi sinh vật
Saccharomyces cerevisiae NM7, Aspergillus oryzae NM1 và Aspergillus niger BS2 để lên men bã sắn phế thải nâng cao chất lƣợng bã sắn.
Võ Thị Hạnh (2003), Viện sinh học nhiệt đới cũng đã thành công với chế phẩm probiotic BIO I dùng trong chăn nuôi lợn. [5]
Kết quả bƣớc đầu của Bùi Quang Tuấn (2005), cho biết bã sắn chế biến thủ công đem ủ chua với 0,5% muối và 3% rỉ mật có thể kéo dài thời gian bảo quản để làm thức ăn dự trữ cho trâu bò. [21]
Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Văn và cộng sự (2008), cũng nhận đƣợc kết quả tƣơng tự. Bã sắn công nghiệp đƣợc ủ chua với các phụ gia khác nhau (cám gạo/rỉ mật, muối ăn) trong túi ny lon có thể bảo quản đƣợc bã sắn để làm thức ăn cho gia súc nhai lại trong điều kiện nông hộ. Hàm lƣợng HCN sau 14 và 21 ngày ủ lần lƣợt giảm xuống dƣới mức 100 và 80 mg/kg khối lƣợng chất khô.
Tác giả Hồ Trung thông (2009) đã nghiên cứu tuyển chọn đƣợc 08 chủng thuộc 04 loài vi sinh vật có tiềm năng (trong điều kiện in vitro) làm probiotic trong chăn nuôi
lợn. Bao gồm các chủng: Saccharomyces cerevisiae LA5, Saccharomyces cerevisiae
LA11, Enterococcus faecium LII3/1, Lactobacillus casei LII5/1, Lactobacillus casei
LII5/2, Lactobacillus casei LII6, Lactobacillus casei LII7, Bacillus subtilis LII4. [19] Nguyễn Hƣng Quang (2010), nghiên cứu ủ chua củ sắn kết hợp lá sắn và cỏ stylo cùng với 0,5% muối trong phòng thí nghiệm làm thức ăn cho lợn thịt. Kết quả cho thấy, trong 90 ngày ủ, có tác dụng làm tăng tỉ lệ vật chất khô và giá trị dinh dƣỡng. [13]
Đào Thị Lƣơng và cộng sự (2010), đã phân lập và tuyển chọn đƣợc 8 chủng vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại. [10]
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới, sắn đƣợc sử dụng nhiều trong chế biến làm thức ăn chăn nuôi dƣới dạng bột hoặc dạng viên, chủ yếu tập trung ở Mỹ Latinh và vùng Caribe, đặc biệt là Brazil. Tạp chí công nghệ sinh học châu Phi (2007) đã đƣa ra các công trình nghiên cứu về giá trị của chất thải sắn, đƣợc sử dụng làm phân bón, sản xuất nhiên liệu sinh học, lên men làm thức ăn chăn nuôi. [24], [29], [45]
Emmanuel N.M (1983), đã nghiên cứu sự tác động của enzyme linamarase lên quá trình khử cyanua trong quá trình lên men sắn tƣơi. [40]
Alexander Essers A.J cùng với cộng sự (1995), đã đƣa ra công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm Geotrichum candidum, Mucor racemosus, Neurospora sitophila, Rhizopus oryzae,Rhizopus stolonifer và chủng Bacillus sp.,lên men trên môi trƣờng sắn trong 72 giờ, kết quả làm giảm hàm lƣợng cyanua từ 62,7% xuống 29,8%. [25]
Wisdom Kofi A. Amoa – Awuacùng cộng sự (1996), đã tiến hành nghiên cứu lên men bột sắn bằng cách sử dụng các chủng vi khuẩn lactic đã làm giảm đáng kể hàm lƣợng cyanua trong bột sắn nhƣ Luctohucillus planturum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides,Streptococcus sp. [26]
Vicki Lei cùng với cộng sự (1999), đã nghiên cứu sự giảm hàm lƣợng cyanogenic glycosides bởi quá trình lên men bột sắn sử dụng các chủng vi khuẩn
Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Candida tropicalis và
Penicillium sclerotiorum. [75]
Muzanila Y.C. cùng với cộng sự (1999), tiến hành so sánh khả năng làm giảm cyanua và độc tố aflatoxin trong sắn của quá trình lên men ƣớt, lên men bán rắn và phơi nắng. Kết quả cho thấy lên men ƣớt bột sắn sẽ làm giảm hàm lƣợng HCN thấp
nhất 5,84 g/kg, tiếp theo là phơi nắng hàm lƣợng HCN 6,8 mg/kg và lên men bán rắn hàm lƣợng HCN 14,0 mg/kg. [58]
Eric Mantey Obilie và cộng sự (2004) tiến hành lên men sắn trong suốt 5 ngày sử dụng các chủng Lactobacillus plantarum accounted, Lactobacillus brevis và Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris đã làm giảm đến 98% hàm lƣợng cyanua tổng, từ 63,3 mg/kg xuống 1,48 mg/kg khối lƣợng chất khô và từ 110,3 mg/kg xuống 2,8 mg/kg khối lƣợng chất khô. [41]
Kobawila S.C. và cộng sự (2005), đã nghiên cứu khả năng khử cyanua của chủng Lactobacillus và Bacillustrên sắn tƣơi và lá sắn, kết quả hơn 70% cyanua đƣợc loại bỏ bởi quá trình lên men. [55]
Cục bảo vệ sức khỏe động vật Nigeria (2008), đã có thử nghiệm cải thiện giá trị dinh dƣỡng của sắn nhờ quá trình lên men bởi các vi sinh vật, hàm lƣợng cyanua giảm từ 42,6 mg/kg xuống 15,2 mg/kg khối lƣợng chất khô và từ đó có thể thay thế cho các các nguồn nguyên liệu đắt tiền trong công thức chế biến thức ăn chăn nuôi. [36]
Naa Ayikailey Adamafio cùng cộng sự (2010) đã sử dụng Aspergillus niger,
Aspergillus flavus và Lactobacillus spp, lên men vỏ sắn bằng dịch bã sắn, kết quả tăng hàm lƣợng protein lên 10 lần và làm giảm hàm lƣợng cyanua đến 12,3%. [59]
Ogbonnaya (2011), đã thu nhận enzyme linamarase từ Lactobacillus delbrueckii
NRRL B-763 đồng thời xác định hoạt độ của enzyme và khả năng thủy phân linamarin củaenzyme này. Sử dụng chủng Lactobacillus delbrueckii NRRL B-763lên men bột sắn, kết quả từ 2,1 HCN/10g mg bột sắn giảm xuống 0,11 mg HCN/10 g bột sắn sau 20 giờ (giảm 95%). [63]
Kết luận: qua các công trình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ta nhận thấy có nhiều nghiên cứu đƣợc ghi nhận, đóng góp lớn trong quá trình làm giảm hàm lƣợng cyanua với mục đích giải độc sắn và sản phẩm sắn. Nhìn chung vấn đề cyanua trong sắn và sản phẩm sắn đƣợc chú trọng, nhiều công trình nghiên cứu đã công bố các chủng vi sinh có khả năng làm giảm hàm lƣợng cyanua tốt và nghiên cứu quá trình lên men nhằm giảm lƣợng cyanua và nâng cao chất lƣợng sản phẩm sắn. Tuy nhiên, đối tƣợng nghiên cứu trong và ngoài nƣớc chỉ tập trung chủ yếu trên đối tƣợng tinh bột sắn và các sản phẩm lên men từ sắn chƣa chú ý tận dụng nguồn nguyên liệu bã sắn. Vấn đề sử dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi chƣa phổ biến, mặc dù đây là một nguồn nguyên liệu dồi dào bởi hàng năm bã sắn từ quá trình sản xuất tinh bột sắn thải ra một lƣợng lớn mà giá thành lại rẻ, nó có thể làm thay thế cho các nguồn nguyên liệu giá thành
cao khác và các nguồn thức ăn tổng hợp. Nhiều nhà nghiên cứu đã đƣa ra công trình ứng dụng bã sắn trong chăn nuôi nhƣng chỉ ở quy mô nhỏ và thời gian lên men để giảm hàm lƣợng cyanua còn quá dài, nhƣ vậy thì khả năng tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại này sẽ bị hạn chế. Đồng thời, việc nghiên cứu sử dụng chủng vi sinh vật trong chăn nuôi cũng đƣợc nhiều tác giả trong nƣớc nghiên cứu. Tuy nhiên, hiện chƣa có nghiên cứu nào đƣa ra đƣợc hệ chủng thích hợp cho bã sắn. Trên bã sắn có hàm lƣợng cyanua cao, cần có chủng vi sinh vật thích hợp, và có khả năng giảm đƣợc chất độc cyanua. Đây cũng là một điểm đƣợc lƣu ý trong nghiên cứu này.
Bên cạnh đó, ở Việt Nam việc định lƣợng hàm lƣợng cyanua chỉ là dựa trên việc xác định hàm lƣợng cyanua tự do mà quên mất rằng ngoài cyanua tự do còn tồn tại hợp chất chứa cyanua ở dạng liên kết (chủ yếu là linamarin) và đây cũng có thể là một trong những nguyên nhân gây nên ngộ độc sắn và sản phẩm sắn khi sử dụng làm thức ăn cho ngƣời và gia súc. Vì vậy, việc xác đinh hàm lƣợng cyanua tổng số (cyanua tự do và cyanua ở dạng liên kết) là cần thiết nên đề tài tập trung nghiên cứu xây dựng quy trình ủ chua bã sắn trên hai đối tƣợng bã sắn tƣơi và bã sắn khô nhằm giảm lƣợng cyanua tổng.
Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Bã sắn thải ra trong quá trình sản xuất tinh bột sắn tại Công ty TNHH Ánh Tuyết, Cam Hải Tây, Cam Lâm, Khánh Hòa. Nghiên cứu trên hai đối tƣợng bã sắn tƣơi và bã sắn khô.
- Rỉ đƣờng là nguyên liệu còn lại của quá trình sản xuất đƣờng tại Công ty cổ phần đƣờng Ninh Hòa, Khánh Hòa.
- Cám gạo, đậu nành đƣợc thu mua tại chợ Vĩnh Hải, Nha Trang, Khánh Hòa. - Chủng Lactobacillus plantarum và Lactobacillus acidophilus do phòng thí nghiệm vi sinh, trung tâm thí nghiệm trƣờng Đại học Nha Trang cung cấp.
- Các chủng vi khuẩn lactic đƣợc có nguồn gốc từ cácthực phẩm lên men lactic nhƣ dƣa chua, sữa chua, nem chua, tôm chua… đƣợc thu thập tại Nha Trang, Khánh Hòa.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Cách tiếp cận
- Xác định phƣơng pháp xử cyanua tổng số trong sắn và bã sắn.
- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn khác nhau để chọn các chủng thích hợp trên môi trƣờng cơ bản là bã sắn. Chú ý đến khả năng khử độc cyanua của chủng phân lập để chọn chủng thích hợp nhất.
- Xác định điều kiện sản xuất chế phẩm sử dụng chủng vi khuẩn lactic đã chọn từ đó xây dựng quy trình ủ chua bã sắn làm thức ăn gia súc sử dụng chế phẩm lactic cho hiệu quả kinh tế cao và hàm lƣợng cyanua tổng số còn lại trong bã sắn sau khi ủ chua thấp nhất.
2.2.2. Sơ đồ quy trình ủ chua bã sắn dự kiến
Sơ đồ quy trình ủ chua bã sắn tƣơi và bã sắn khô dự kiến đƣợc trình bày ở Hình 2.1 và Hình 2.2.
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình ủ chua bã sắn tƣơi sử dụng chế phẩm lactic dự kiến
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình ủ chua bã sắn khô sử dụng chế phẩm lactic dự kiến
NaCl 0,5% (w/w) Bột đậu nành 5% (w/w) Hàm lƣợng chất bổ sung ? Tỉ lệ chế phẩm/bã sắn ? Hàm lƣợng ẩm của bã sắn ? Thời gian ? Nhiệt độ ?
pH của nguyên liệu
Sản phẩm bã sắn dùng trong chăn nuôi gia súc thích hợp Ủ chua Bã sắn khô