4. Nội dung nghiên cứu
1.4.2.Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới, sắn đƣợc sử dụng nhiều trong chế biến làm thức ăn chăn nuôi dƣới dạng bột hoặc dạng viên, chủ yếu tập trung ở Mỹ Latinh và vùng Caribe, đặc biệt là Brazil. Tạp chí công nghệ sinh học châu Phi (2007) đã đƣa ra các công trình nghiên cứu về giá trị của chất thải sắn, đƣợc sử dụng làm phân bón, sản xuất nhiên liệu sinh học, lên men làm thức ăn chăn nuôi. [24], [29], [45]
Emmanuel N.M (1983), đã nghiên cứu sự tác động của enzyme linamarase lên quá trình khử cyanua trong quá trình lên men sắn tƣơi. [40]
Alexander Essers A.J cùng với cộng sự (1995), đã đƣa ra công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm Geotrichum candidum, Mucor racemosus, Neurospora sitophila, Rhizopus oryzae,Rhizopus stolonifer và chủng Bacillus sp.,lên men trên môi trƣờng sắn trong 72 giờ, kết quả làm giảm hàm lƣợng cyanua từ 62,7% xuống 29,8%. [25]
Wisdom Kofi A. Amoa – Awuacùng cộng sự (1996), đã tiến hành nghiên cứu lên men bột sắn bằng cách sử dụng các chủng vi khuẩn lactic đã làm giảm đáng kể hàm lƣợng cyanua trong bột sắn nhƣ Luctohucillus planturum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides,Streptococcus sp. [26]
Vicki Lei cùng với cộng sự (1999), đã nghiên cứu sự giảm hàm lƣợng cyanogenic glycosides bởi quá trình lên men bột sắn sử dụng các chủng vi khuẩn
Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Candida tropicalis và
Penicillium sclerotiorum. [75]
Muzanila Y.C. cùng với cộng sự (1999), tiến hành so sánh khả năng làm giảm cyanua và độc tố aflatoxin trong sắn của quá trình lên men ƣớt, lên men bán rắn và phơi nắng. Kết quả cho thấy lên men ƣớt bột sắn sẽ làm giảm hàm lƣợng HCN thấp
nhất 5,84 g/kg, tiếp theo là phơi nắng hàm lƣợng HCN 6,8 mg/kg và lên men bán rắn hàm lƣợng HCN 14,0 mg/kg. [58]
Eric Mantey Obilie và cộng sự (2004) tiến hành lên men sắn trong suốt 5 ngày sử dụng các chủng Lactobacillus plantarum accounted, Lactobacillus brevis và Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris đã làm giảm đến 98% hàm lƣợng cyanua tổng, từ 63,3 mg/kg xuống 1,48 mg/kg khối lƣợng chất khô và từ 110,3 mg/kg xuống 2,8 mg/kg khối lƣợng chất khô. [41]
Kobawila S.C. và cộng sự (2005), đã nghiên cứu khả năng khử cyanua của chủng Lactobacillus và Bacillustrên sắn tƣơi và lá sắn, kết quả hơn 70% cyanua đƣợc loại bỏ bởi quá trình lên men. [55]
Cục bảo vệ sức khỏe động vật Nigeria (2008), đã có thử nghiệm cải thiện giá trị dinh dƣỡng của sắn nhờ quá trình lên men bởi các vi sinh vật, hàm lƣợng cyanua giảm từ 42,6 mg/kg xuống 15,2 mg/kg khối lƣợng chất khô và từ đó có thể thay thế cho các các nguồn nguyên liệu đắt tiền trong công thức chế biến thức ăn chăn nuôi. [36]
Naa Ayikailey Adamafio cùng cộng sự (2010) đã sử dụng Aspergillus niger,
Aspergillus flavus và Lactobacillus spp, lên men vỏ sắn bằng dịch bã sắn, kết quả tăng hàm lƣợng protein lên 10 lần và làm giảm hàm lƣợng cyanua đến 12,3%. [59]
Ogbonnaya (2011), đã thu nhận enzyme linamarase từ Lactobacillus delbrueckii
NRRL B-763 đồng thời xác định hoạt độ của enzyme và khả năng thủy phân linamarin củaenzyme này. Sử dụng chủng Lactobacillus delbrueckii NRRL B-763lên men bột sắn, kết quả từ 2,1 HCN/10g mg bột sắn giảm xuống 0,11 mg HCN/10 g bột sắn sau 20 giờ (giảm 95%). [63]
Kết luận: qua các công trình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ta nhận thấy có nhiều nghiên cứu đƣợc ghi nhận, đóng góp lớn trong quá trình làm giảm hàm lƣợng cyanua với mục đích giải độc sắn và sản phẩm sắn. Nhìn chung vấn đề cyanua trong sắn và sản phẩm sắn đƣợc chú trọng, nhiều công trình nghiên cứu đã công bố các chủng vi sinh có khả năng làm giảm hàm lƣợng cyanua tốt và nghiên cứu quá trình lên men nhằm giảm lƣợng cyanua và nâng cao chất lƣợng sản phẩm sắn. Tuy nhiên, đối tƣợng nghiên cứu trong và ngoài nƣớc chỉ tập trung chủ yếu trên đối tƣợng tinh bột sắn và các sản phẩm lên men từ sắn chƣa chú ý tận dụng nguồn nguyên liệu bã sắn. Vấn đề sử dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi chƣa phổ biến, mặc dù đây là một nguồn nguyên liệu dồi dào bởi hàng năm bã sắn từ quá trình sản xuất tinh bột sắn thải ra một lƣợng lớn mà giá thành lại rẻ, nó có thể làm thay thế cho các nguồn nguyên liệu giá thành
cao khác và các nguồn thức ăn tổng hợp. Nhiều nhà nghiên cứu đã đƣa ra công trình ứng dụng bã sắn trong chăn nuôi nhƣng chỉ ở quy mô nhỏ và thời gian lên men để giảm hàm lƣợng cyanua còn quá dài, nhƣ vậy thì khả năng tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại này sẽ bị hạn chế. Đồng thời, việc nghiên cứu sử dụng chủng vi sinh vật trong chăn nuôi cũng đƣợc nhiều tác giả trong nƣớc nghiên cứu. Tuy nhiên, hiện chƣa có nghiên cứu nào đƣa ra đƣợc hệ chủng thích hợp cho bã sắn. Trên bã sắn có hàm lƣợng cyanua cao, cần có chủng vi sinh vật thích hợp, và có khả năng giảm đƣợc chất độc cyanua. Đây cũng là một điểm đƣợc lƣu ý trong nghiên cứu này.
Bên cạnh đó, ở Việt Nam việc định lƣợng hàm lƣợng cyanua chỉ là dựa trên việc xác định hàm lƣợng cyanua tự do mà quên mất rằng ngoài cyanua tự do còn tồn tại hợp chất chứa cyanua ở dạng liên kết (chủ yếu là linamarin) và đây cũng có thể là một trong những nguyên nhân gây nên ngộ độc sắn và sản phẩm sắn khi sử dụng làm thức ăn cho ngƣời và gia súc. Vì vậy, việc xác đinh hàm lƣợng cyanua tổng số (cyanua tự do và cyanua ở dạng liên kết) là cần thiết nên đề tài tập trung nghiên cứu xây dựng quy trình ủ chua bã sắn trên hai đối tƣợng bã sắn tƣơi và bã sắn khô nhằm giảm lƣợng cyanua tổng.
Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Bã sắn thải ra trong quá trình sản xuất tinh bột sắn tại Công ty TNHH Ánh Tuyết, Cam Hải Tây, Cam Lâm, Khánh Hòa. Nghiên cứu trên hai đối tƣợng bã sắn tƣơi và bã sắn khô.
- Rỉ đƣờng là nguyên liệu còn lại của quá trình sản xuất đƣờng tại Công ty cổ phần đƣờng Ninh Hòa, Khánh Hòa.
- Cám gạo, đậu nành đƣợc thu mua tại chợ Vĩnh Hải, Nha Trang, Khánh Hòa. - Chủng Lactobacillus plantarum và Lactobacillus acidophilus do phòng thí nghiệm vi sinh, trung tâm thí nghiệm trƣờng Đại học Nha Trang cung cấp.
- Các chủng vi khuẩn lactic đƣợc có nguồn gốc từ cácthực phẩm lên men lactic nhƣ dƣa chua, sữa chua, nem chua, tôm chua… đƣợc thu thập tại Nha Trang, Khánh Hòa.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Cách tiếp cận
- Xác định phƣơng pháp xử cyanua tổng số trong sắn và bã sắn.
- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn khác nhau để chọn các chủng thích hợp trên môi trƣờng cơ bản là bã sắn. Chú ý đến khả năng khử độc cyanua của chủng phân lập để chọn chủng thích hợp nhất.
- Xác định điều kiện sản xuất chế phẩm sử dụng chủng vi khuẩn lactic đã chọn từ đó xây dựng quy trình ủ chua bã sắn làm thức ăn gia súc sử dụng chế phẩm lactic cho hiệu quả kinh tế cao và hàm lƣợng cyanua tổng số còn lại trong bã sắn sau khi ủ chua thấp nhất.
2.2.2. Sơ đồ quy trình ủ chua bã sắn dự kiến
Sơ đồ quy trình ủ chua bã sắn tƣơi và bã sắn khô dự kiến đƣợc trình bày ở Hình 2.1 và Hình 2.2.
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình ủ chua bã sắn tƣơi sử dụng chế phẩm lactic dự kiến
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình ủ chua bã sắn khô sử dụng chế phẩm lactic dự kiến
NaCl 0,5% (w/w) Bột đậu nành 5% (w/w) Hàm lƣợng chất bổ sung ? Tỉ lệ chế phẩm/bã sắn ? Hàm lƣợng ẩm của bã sắn ? Thời gian ? Nhiệt độ ?
pH của nguyên liệu
Sản phẩm bã sắn dùng trong chăn nuôi gia súc thích hợp Ủ chua Bã sắn khô Chế phẩm lactic Chủng lactic NaCl 0,5% (w/w) Hàm lƣợng chất bổ sung ? Tỉ lệ chế phẩm/bã sắn ? Thời gian ? Nhiệt độ ?
pH của nguyên liệu
Sản phẩm bã sắn dùng trong chăn nuôi gia súc thích hợp
Ủ chua Bã sắn tƣơi Chế phẩm lactic
Giải thích quy trình:
Mục đích của đề tài là nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng chế phẩm lactic từ bã sắn lên men cho các hộ chăn nuôi trong điều kiện khó khăn nhƣ khó điều chỉnh pH môi trƣờng và nhiệt độ ủ. Do vậy, đề tài chú ý đến nghiên cứu các công đoạn: tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic, nhân giống sản xuất chế phẩm lactic và thử nghiệm chế phẩm lactic vào quá trình ủ chua trên hai đối tƣợng bã sắn (bã sắn tƣơi và bã sắn khô).
Mục tiêu của công đoạn tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic là chọn đƣợc chủng lactic có khả năng khử cyanua tổng số đến mức thấp nhất.
Mục tiêu của công đoạn nhân giống sản xuất chế phẩm lactic là tạo ra đƣợc một chủng giống sinh trƣởng và phát triển tốt trên môi trƣờng bã sắn. Các thông số ảnh hƣởng đến công đoạn này là pH (pH của nguyên liệu), hàm lƣợng ẩm của bã sắn, tỉ lệ đậu nành/bã sắn, thời gian và nhiệt độ nhân giống. Quá trình nhân giống đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 30 ± 2 o
C và giá trị pH là pH của nguyên liệu. Công đoạn này sẽ nghiên cứu tỉ lệ đậu nành/bã sắn, thời gian nhân giống và hàm lƣợng ẩm của bã sắn để sản xuất chế phẩm lactic có mật độ vi khuẩn lactic cao nhất.
Mục tiêu của công đoạn ủ chua bã sắn tƣơi là xác định một số điều kiện ủ chua bã sắn tƣơi nhằm khử đƣợc hàm lƣợng cyanua tổng xuống dƣới mức 100 mg/kg khối lƣợng chất khô. Các thông số ảnh hƣởng đến quá trình ủ chua bã sắn tƣơi là nhiệt độ, thời gian, pH, tỉ lệ chế phẩm/bã sắn, thành phần và hàm lƣợng chất bổ sung. Quá trình ủ chua đƣợc tiến hành ở giá trị pH là pH của nguyên liệu. Các thông số cần nghiên cứu trong công đoạn này là thành phần và hàm lƣợng chất bổ sung, tỉ lệ chế phẩm lactic/bã sắn, nhiệt độ ủ, thời gian ủ để khử đƣợc lƣợng cyanua tổng < 100 mg/kg khối lƣợng chất khô.
Mục tiêu của công đoạn ủ chua bã sắn khô là xác định một số điều kiện ủ chua bã sắn khô nhằm khử đƣợc hàm lƣợng cyanua tổng lớn nhất. Các thông số ảnh hƣởng đến quá trình ủ chua bã sắn khô là nhiệt độ, thời gian, pH, tỉ lệ chế phẩm/bã sắn, hàm lƣợng ẩm của bã sắn. Quá trình ủ chua đƣợc tiến hành ở giá trị pH là pH của nguyên liệu. Các thông số cần nghiên cứu trong công đoạn này là tỉ lệ chế phẩm lactic/bã sắn, nhiệt độ ủ, thời gian ủ, hàm lƣợng ẩm của bã sắnđể khử đƣợc lƣợng cyanua tổng trong bã sắn cao nhất.
2.2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Sơ đồ nghiên cứu tổng quát đƣợc chỉ ra ở Hình 2.3.
Hình 2.3: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
2.3. Bố trí thí nghiệm
2.3.1. Phương pháp xác định hàm lượng cyanua tổng trong sắn và bã sắn
2.3.1.1. Xác định hoạt độ của linamarase
Thu linamarin
Linamarin đƣợc sử dụng để xác định khả năng thủy phân của enzyme linamarase. 5 g lá sắn non đƣợc cắt nhỏ, giã với 5 ml HCl 0,1 M bằng cối chày thủy tinh, lọc thu dịch đục màu hồng. Tiến hành li tâm, thu đƣợc dịch trong nổi lên trên. Khoảng 7 ml chất dịch này đƣợc lấy ra bằng pipet Pasteur. Dịch này có chứa linamarin và linamarase (bất hoạt trong HCl 0,1M), đƣợc bảo quản ở - 20 o
C. [67]
Thu linamarase từ nhựa sắn
Thu linamarase từ nhựa sắn (nhựa cây). Nhựa đƣợc thu trực tiếp trên cây sắn ở cuối thân của cuống lá sắn, sau đó trộn với nƣớc cất trên cơ sở 10 ml cho 0,1 g nhựa sắn, dịch lọc này chứa enzyme thô, bảo quản ở nhiệt độ đông sâu. [61], [68]
Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp trên môi trƣờng bã sắn có khả năng khử cyanua tổng đến mức thấp nhất từ các nguồn thực phẩm lên men lactic tự nhiên (nem chua, kim chi, sữa chua, dƣa chua),…
Nghiên cứu xác định điều kiện sản xuất chế phẩm và bảo quản chủng giống
Quy trình ủ chua bã sắn làm thức ăn gia súc sử dụng chế phẩm lactic Xác định phƣơng pháp khử cyanua tổng trong sắn và bã sắn
Hoạt độ của linamarase: đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Rezaul Haque M. [68]. Hoạt độ linamarase là lƣợng linamarase xúc tác để thủy phân 1 ml linamarin tạo thành 1µmol HCN trong thời gian 1 phút.
2.3.1.2. Xác định lƣợng linamarase thích hợp nhằm thủy phân hoàn toàn linamarin Một lƣợng (0; 0,09; 0,37; 0,75; 1,12; 0,025; 1,31; 1,5 đơn vị) linamarase thu từ Một lƣợng (0; 0,09; 0,37; 0,75; 1,12; 0,025; 1,31; 1,5 đơn vị) linamarase thu từ nhựa lá sắn non đƣợc thêm vào trong bình kín chứa 10 g bã sắn tƣơi (ứng với 1,7g chất khô), phản ứng thủy phân diễn ra ở 30 ± 2 o
C trong 15 phút. Tiến hành xác định hàm lƣợng HCN đƣợc giải phóng.
2.3.1.3. Xác định hàm lƣợng cyanua trong sắn và bã sắn
Acid cyanhydric tự do trong sắn và bã sắn đƣợc định lƣợng bằng cách ngâm 10 – 20 g mẫu trong nƣớc và dùng hơi nƣớc chƣng cất lôi cuốn chuyển acid cyanhydric vào dung dịch NaOH 2,5%. Sau đó chuẩn độ dung dịch thu đƣợc bằng dung dịch AgNO3 0,02 N với sự có mặt của KI 5% [1]. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không thể định lƣợng linamarin tồn tại bên trong tế bào. Do đó, sử dụng linamarase có nguồn gốc từ nhựa lá sắn non ở pH tự nhiên để thủy phân linamarin giải phóng acid cyanhydric, phản ứng diễn ra ở 30 ± 2 o
C trong 15 phút, sau đó tiến hành định lƣợng acid này.
2.3.2. Bố trí thí nghiệm tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp trên môi trường bã sắn nhằm giảm hàm lượng cyanua tổng đến mức thấp nhất bã sắn nhằm giảm hàm lượng cyanua tổng đến mức thấp nhất
2.3.2.1. Bố trí thí nghiệm tuyển chủng vi khuẩn lactic
Mục đích: tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp trên môi trƣờng cơ bản là bã sắn có khả năng khử cyanua tổng số đến mức thấp nhất.
Tiến hành: ủ chua bã sắn (100 g) với 10 ml dịch chứa các nguồn vi khuẩn khác nhau từ sản phẩm lên men lactic tự nhiên (dƣa chua, nem chua, kim chi, sữa chua),... trong 48 h, pH tự nhiên của nguyên liệu và nhiệt độ 30 ± 2 oC, xác định hàm lƣợng cyanua tổng số sau mỗi mẻ ủ chua. Lựa chọn những mẫu ủ bã sắn có hàm lƣợng cyanua tổng số giảm để tiếp tục thí nghiệm. Tiến hành cấy ria phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng thạch MRS, ủ ấm 24 h, kiểm tra sự phát triển và hình thái của khuẩn lạc lactic (nhuộm kép, soi kính hiển vi). Tiến hành cấy ria nhiều lần nhằm thu đƣợc chủng lactic thuần và giữ giống trên môi trƣờng thạch nghiêng và thạch đứng. Tiếp tục ủ chua bã sắn với các chủng vi khuẩn latic thu đƣợc, sau mỗi mẻ lên men, xác định hàm lƣợng cyanua tổng số để kiểm tra khả năng khử cyanua và mức độ thích nghi của
chủng vi khuẩn lactic. Tiến hành lặp đi lặp lại thí nghiệm nhiều lần. So sánh kết quả các lần thí nghiệm để tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng khử cyanua tổng số đến mức thấp nhất. Định danh chủng vi khuẩn lactic đã chọn.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm thể hiện trong Hình 2.4.
Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
2.3.2.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng chuyển hóa của chủng vi khuẩn lactic đối với cyanua đối với cyanua
Mục đích: đánh giá khả năng chuyển hóa cyanua của vi khuẩn lactic.
Tiến hành: chủng lactic tiến hành nhân giống cấp 1 trên môi trƣờng MRS, sau đó tiến hành nuôi sinh khối trong 100 ml MRS lỏng với 1,5% linamarin ở 30 ± 2 o
C. Sau 24 giờ phá vỡ tế bào vi khuẩn lactic ở tần số 250 KHz, 25 oC trong 20 phút [44]. Xác định hàm lƣợng cyanua trƣớc và sau khi phá vỡ tế bào vi khuẩn lactic. Từ đó kết luận về sự tồn tại của cyanua bên trong tế bào lactic.
Thực phẩm lên men lactic tự nhiên
Bã sắn
Làm giàu vi khuẩn lactic trên môi trƣờng bã sắn
Xác định hàm lƣợng cyanua tổng còn lại trong bã sắn
Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic phù hợp
Cấy chuyển nhiều lần
Sơ đồ bố trí thí nghiệm thể hiện trong Hình 2.5.
Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng chuyển hóa của vi khuẩn lactic đối với cyanua
2.3.2.3. Định danh chủng vi khuẩn lacticc tuyển chọn đƣợc