1.2. Tổng quan về phytosome
1.2.5. Kỹ thuật bào chế phytosome
Quy trình bào chế phytosome nói chung được chia thành hai giai đoạn: Giai đoạn 1 - tạo phức hợp hoạt chất với phospholipid; giai đoạn 2 - phân lập phytosome.
Các phương pháp bào chế khác nhau ở giai đoạn tách phytosome sau quá trình tạo phức.
Giai đoạn 1: Tạo phytosome
- Chuẩn bị dung dịch hoạt chất - phospholipid: Hòa hỗn hợp phospholipid, hoạt chất và các thành phần khác trong dung môi thích hợp. Nếu độ tan của PL và hoạt chất rất khác nhau, có thể lựa chọn hai dung môi đồng tan. Yêu cầu của dung môi hay hỗn hợp dung môi là phải có khả năng hòa tan tốt hoạt chất, tá dược và dễ bay hơi. Ngoài ra, để quá trình bốc hơi không quá dài ảnh hưởng đến độ ổn định của phytosome, nên sử dụng lượng dung môi tối thiểu để có thể hòa tan hết được hoạt chất, PL.
- Tạo phytosome: Tiến hành khuấy trộn trong một khoảng thời gian và nhiệt độ phù hợp nhằm đảm bảo hoạt chất phản ứng hết với PL tạo phytosome.
Tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa, hình dạng và độ ổn định của phytosome bào chế phụ thuộc vào:
+ Thành phần phytosome:
Phospholipid: Thành phần và bản chất PL quyết định tính chất phytosome.
Khi độ tinh khiết của PL tăng thì khả năng phytosome hóa hoạt chất, độ ổn định tăng và ngược lại. Do đó, tùy theo mục đích nghiên cứu và sử dụng (dùng qua da, đường uống) có thể lựa chọn loại PL có độ tinh khiết phù hợp. Ngoài ra, tính chất của chuỗi acid béo cũng ảnh hưởng đến độ ổn định của phytosome. Trong trường hợp sử dụng PL không no (như PC lòng đỏ trứng, phosphatidylglycerin…), màng phytosome dễ bị oxy hóa dẫn đến hỏng màng, gây rò rỉ hoạt chất, có thể thay thế bằng PL bão hòa (dipalmytoyl phosphatidylcholin, dipalmitidyl phosphatidic,…).
Cholesterol và dẫn chất: Do đặc tính về cấu trúc phân tử và độ tan, cholesterol lấp vào các khoang của PL kép làm tăng độ vững chắc, độ đặc khít và độ dày của màng phytosome, qua đó ổn định màng, giảm tính thấm của phytosome với các chất điện phân, không điện phân và chống rò rỉ hoạt chất trong quá trình bảo quản. Vì vậy, trong một số nghiên cứu đã thêm cholesterol vào thành phần phytosome, sự kết hợp PC: cholesterol (tỷ lệ 1:0,1) đã cải thiện đáng kể độ ổn định vật lý của phytosome quercetin trong thời gian 3 tuần [116]. Hoặc cholesterol kết hợp với lecithin (3 : 1) thu được các tiểu phân phytosome tecomella undulate hình cầu, nhỏ, đơn lớp với KTTP 153,2 nm; thế Zeta -23,5 mV và hiệu suất phytosome hóa đạt 90 % [89]. Có
17
thể phối hợp cholesterol với PL ở tỷ lệ rất cao (100 - 200 %). Tuy nhiên, lượng cholesterol lớn nhất có thể thêm vào phytosome được báo cáo trong nhiều nghiên cứu trước đây không quá 50 % mol so với lượng PL sử dụng [148]. Do tỷ lệ cholesterol quá cao có thể ảnh hưởng ngược lại đối với sự bền vững của màng.
Hoạt chất: Việc đảm bảo/kiểm soát chất lượng của hoạt chất (hàm lượng hoạt chất, tạp chất, tồn dư dung môi…) là cần thiết bởi vì thông số này sẽ ảnh hưởng tới chất lượng phytosome bào chế (tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa, KTTP, độ tan..). Trong chế phẩm MERIVA® TURMERIC PHYTOSOME, yêu cầu phải kiểm soát hàm lượng curcuminoid trong khoảng 18 - 22 % [128].
Tỷ lệ hoạt chất : PL (mol:mol) có thể từ 0,5:1 đến 3:1 [107], [115]. Một số nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ 1:1 [102], [116], [148]. Ví dụ, phytosome với tỷ lệ rutin : PL (1:1) có hệ số phân bố dầu/nước (3,11 ± 0,08) cân bằng hơn nguyên liệu và đạt hiệu suất phytosome hóa 99,62 % [117]. Tuy nhiên, tỷ lệ 1:1 không phải là tỷ lệ tối ưu cho tất cả các nghiên cứu bào chế phytosome. Sau quá trình khảo sát các tỷ lệ silymarin - PL khác nhau 1:5, 1:10 và 1:15, Maryanaa W. và cộng sự nhận thấy phytosome bào chế với tỷ lệ 1:5 cho hiệu suất phytosome hóa cao nhất [83]. Trong khi đó, Yue P. F. và cộng sự lựa chọn tỷ lệ oxymatrin : PL là 3:1 cho nghiên cứu của mình [148]. Do đó, tùy loại hoạt chất và loại PL sử dụng để lựa chọn tỷ lệ hoạt chất : PL phù hợp.
Dung môi: Nếu nghiên cứu sử dụng dung môi hữu cơ, cần kiểm soát lượng dung môi tồn dư để đảm bảo độ tinh khiết cho phytosome. Nhằm tăng khả năng ứng dụng phytosome trên lâm sàng đồng thời vẫn đảm bảo độ tan của hoạt chất và PL thì dung môi thân nước như ethanol là giải pháp thay thế hiệu quả. Năm 2016, Maryanaa và cộng sự đã tiến hành bào chế phytosome silymarin trong ethanol với hiệu suất phytosome hóa cao trên 97 % [83]. Ethanol cũng là dung môi hòa tan PC và epigallocatechin gallat; kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của phytosome trên mô hình in vitro cho thấy sự gia tăng tác dụng trị liệu [136].
+ Điều kiện bào chế:
Thời gian phối hợp hoạt chất - PL phải phù hợp, đảm bảo tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa cao.
Nhiệt độ phối hợp hoạt chất với PL cần được xác định theo nhiệt độ chuyển dạng của PL nhằm đảm bảo tính linh động của PL. Ví dụ, bào chế phytosome rutin [35], phytosome oxymatrin [148] sử dụng PL là PC nên nhiệt độ phối hợp là 60oC.
Trong trường hợp sử dụng lecithin, nhiệt độ tạo phytosome với hoạt chất (Lawson,..) sẽ thấp hơn, không quá 40oC [119].
18
Giai đoạn 2: Phân lập phytosome
Các phương pháp bào chế khác nhau ở giai đoạn tách phytosome sau quá trình tạo phức. Hai phương pháp hay được áp dụng trong các nghiên cứu hiện nay là bốc hơi dung môi và kết tủa trong dung môi. Mỗi phương pháp có những ưu, nhược điểm riêng, và dựa vào kết quả thực nghiệm cũng như mục đích nghiên cứu và sử dụng mà lựa chọn phương pháp phù hợp.
- Phương pháp bốc hơi dung môi: là phương pháp hay được áp dụng trong các nghiên cứu bào chế phytosome với hướng ứng dụng vào dạng viên [23], [68].
+ Sau khi tạo phytosome, tiến hành bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm trong bình cất quay. Nghiên cứu tiến hành trên máy cất quay do thiết bị có nhiều loại từ quy mô nhỏ đến lớn, thu hồi được dung môi và tiện lợi cho quá trình hydrat hóa tiếp theo. Khi cần thu lấy phytosome dưới dạng bột, tiếp tục làm khô phytosome dưới chân không hoặc sục khí nitơ để loại tối đa lượng dung môi tồn dư.
+ Để thu được hỗn dịch phytosome có thể tiển hành hydrat hóa: Cho môi trường hydrat hóa vào bình, lắc hoặc quay để phân tán đều phytosome. Môi trường hydrat hóa có thể là nước cất, hệ đệm… Nhưng do hoạt chất quercetin kém bền trong nhiều môi trường có pH cao nên các loại đệm ít được sử dụng để nghiên cứu bào chế phytosome quercetin.
+ Sau khi bào chế, có thể thu hồi phần hoạt chất không liên kết với PL trong phytosome bằng phương pháp ly tâm hoặc dùng dung môi có khả năng hòa tan chọn lọc.
Ưu điểm của phương pháp này là kỹ thuật bào chế tương đối đơn giản, không yêu cầu trang thiết bị phức tạp, thuận lợi trong nâng cấp quy mô, dung môi được thu hồi để tái sử dụng và phytosome thu được dưới dạng bột dễ dàng ứng dụng trong dạng rắn (viên nén, viên nang). Tuy nhiên, hạn chế là thời gian cần để loại bỏ hoàn toàn dung môi khá dài (khoảng 16 - 20 giờ) nên khó tự động hóa cũng như khó sản xuất mẻ lớn. Ngoài ra, phytosome bào chế theo phương pháp này thường có kích thước lớn, phụ thuộc vào nhiệt độ hydrat hóa, thời gian hydrat hóa và tốc độ quay trong quá trình hydrat hóa. Do đó, cần khảo sát, lựa chọn phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân phù hợp.
- Phương pháp kết tủa trong dung môi
+ Sau khi tạo phytosome, bơm nhanh dung dịch này vào môi trường hydrocarbon béo, n-hexan [108], vừa bơm vừa khuấy thu lấy hỗn dịch phytosome.
Có thể hòa tan vào môi trường phân tán một lượng nhỏ các chất ion hóa, chất làm tăng độ nhớt nhằm làm tăng độ ổn định của hỗn dịch thông qua việc hạn chế khả
19
năng kết tụ, chống sa lắng các tiểu phân cũng như gia tăng thế Zeta của hệ phân tán.
Khi cần thu lấy phytosome dưới dạng bột, tiến hành thêm giai đoạn sấy trong tủ sấy chân không hoặc áp dụng phương pháp đông khô.
Một số thông số ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng phytosome là dung môi kết tủa, nhiệt độ và tốc độ khuấy môi trường trong giai đoạn phân lập phytosome, đường kính kim bơm và tốc độ bơm,… Phương pháp này đơn giản, phytosome thu được có kích thước nhỏ và tương đối đồng nhất. Tuy nhiên khó tiến hành trên quy mô lớn.
Tác giả Rudra Pratap Singh và cộng sự [119] khi nghiên cứu bào chế phytosome Lawson đã thu được một số kết quả sau:
+ Về ảnh hưởng của phương pháp: So sánh phương pháp bốc hơi dung môi và phương pháp kết tủa trong dung môi, các tác giả nhận thấy phytosome bào chế theo hai phương pháp khác nhau nhiều về KTTP. Phương pháp kết tủa trong dung môi tạo ra phytosome có kích thước nhỏ và đồng nhất hơn (254,88 nm so với 751,46 nm). Tuy nhiên, không có sự khác nhau đáng kể về hiệu suất phản ứng và hiệu suất phytosome hóa (EE) giữa hai phương pháp.
+ Về ảnh hưởng của tỷ lệ hoạt chất : lecithin: Khảo sát 4 tỷ lệ 1:1; 1:2; 2:1;
2:2 nhận thấy khi tỷ lệ hoạt chất hoặc PL tăng thì kích thước phytosome tăng và đã chọn tỷ lệ 1:1 cho thực nghiệm.
+ Về hiệu suất phytosome hóa đạt 97,7 % (do hoạt chất tương tác với PL).
+ Về tính thấm: Sau khi bôi gel chứa 2 % khối lượng phytosome Lawson lên da có 92,91 % hoạt chất thấm qua sau 6 giờ, do đó thể hiện hoạt tính chống viêm cao hơn hẳn so với gel chứa hoạt chất tinh khiết (p < 0,01).
- Phương pháp siêu tới hạn phù hợp để bào chế các tiểu phân phytosome có kích thước dao động từ 5 - 2000 nm. Phương pháp này tương tự phương pháp kết tủa trong dung môi. Trong đó, dung môi kết tủa là một chất lỏng đặc biệt tồn tại ở trạng thái siêu tới hạn (thường dùng CO2) [34].