CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của quercetin và
2.2.3.1. Thẩm định phương pháp định lượng quercetin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC hoặc quang phổ hấp thụ UV - Vis
a) Thẩm định phương pháp định lượng quercetin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Theo USP 41 [124], tham khảo một số tài liệu [100], [122], [138] và qua các khảo sát sơ bộ ban đầu, hàm lượng quercetin trong nguyên liệu, hàm lượng quercetin có trong phytosome được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
- Thuốc thử:
+ Acid phosphoric đặc + Methanol
- Điều kiện sắc ký:
+ Cột sắc ký: Cột Apollo C18, kích thước cột 4,6 × 250 mm, đường kính hạt nhồi 5 àm; bảo vệ cột Apollo C18 (4,6 ì 12,5 mm, 5 àm).
+ Pha động: hỗn hợp acid phosphoric 0,2 % trong nước và methanol với tỷ lệ 40:60 về thể tớch (v/v), lọc qua màng celulose acetat 0,45 àm, rồi siờu õm 15 phỳt.
+ Tốc độ dòng pha động: 1 ml/phút.
+ Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl.
+ Detector UV, bước sóng 370 nm.
38 - Chuẩn bị mẫu:
+ Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg quercetin chuẩn hòa tan trong methanol trong bình định mức 100 ml, bổ sung methanol đến thể tích vừa đủ và lắc kỹ được dung dịch gốc cú nồng độ 100 àg/ml. Hỳt chớnh xỏc 2 ml dung dịch gốc, pha loãng bằng methanol trong bình định mức 10 ml, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ thớch hợp. Lọc dung dịch qua màng lọc kớch thước lỗ lọc 0,45 àm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký.
+ Mẫu thử: Mẫu thử là bột phytosome quercetin được bào chế theo phương pháp bốc hơi dung môi với tỷ lệ quercetin : HSPC (mol:mol) là 1:1; thời gian, nhiệt độ và tốc độ phối hợp quercetin và HSPC lần lượt là 6 giờ, 80oC và 50 v/ph. Mẫu thử được chuẩn bị tương tự như mẫu chuẩn với lượng bột phytosome quercetin tương ứng với 10 mg quercetin.
+ Mẫu trắng: Mẫu trắng bào chế như mẫu thử phytosome quercetin nhưng không có hoạt chất quercetin. Mẫu trắng được xử lý như mẫu thử.
- Để đảm bảo phương pháp là chính xác trong khoảng giới hạn nồng độ hoạt chất được khảo sát, quy trình thẩm định phương pháp định lượng được tiến hành theo hướng dẫn của ICH [56]:
+ Độ đặc hiệu: Tiến hành tiêm mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã lựa chọn và đánh giá pic sắc ký xuất hiện trên sắc ký đồ. Yêu cầu pic của quercetin được nhận diện rõ trên sắc ký đồ của mẫu chuẫn và mẫu thử và không xuất hiện pic lạ tại thời điểm trùng với thời gian lưu của quercetin trên sắc ký đồ của mẫu trắng.
+ Tớnh thớch hợp của hệ thống: Tiờm mẫu chuẩn cú nồng độ 20 àg/ml lặp lại 6 lần qua hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic trung bình và các thông số khác của pic (hệ số đối xứng..). Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic phải ≤ 2,0 %.
+ Tính tuyến tính: Chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 5
g/ml đến 35 g/ml. Tiêm lần lượt vào hệ sắc thống sắc ký theo chương trình đã lựa chọn. Sau đó xác định mối tương quan giữa nồng độ quercetin và diện tích pic.
Trong trường hợp giá trị R2 ≥ 0,9 chứng tỏ trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ quercetin trong mẫu chuẩn với diện tích pic.
+ Độ chính xác: Tiến hành định lượng 6 mẫu thử độc lập. Xác định hàm lượng quercetin có trong các mẫu thử theo phương trình hồi quy tuyến tính. Độ
39
chính xác của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong phytosome quercetin. Yêu cầu RSD ≤ 2,0 %
+ Độ đúng: Sử dụng phương pháp thêm chuẩn. Các dung dịch thử thêm chuẩn được chuẩn bị bằng cách cân chính xác một lượng bột phytosome quercetin tương ứng với 10 mg quercetin hòa tan trong methanol trong bình định mức 100 ml, thêm một lượng quercetin chuẩn tương ứng với 10, 20 và 30 % so với lượng hoạt chất có sẵn trong mẫu thử, bổ sung methanol đến thể tích vừa đủ và lắc kỹ. Hút chính xác 2 ml dung dịch và pha loãng bằng methanol trong bình định mức 10 ml.
Tiến hành sắc ký 9 dung dịch thử thêm chuẩn. Yêu cầu phần trăm tìm lại của các mẫu ở 3 mức nồng độ nằm trong khoảng từ 98,0 - 102,0 %.
b) Thẩm định phương pháp định lượng quercetin bằng quang phổ hấp thụ UV- Vis theo hướng dẫn của ICH [56]:
- Chuẩn bị mẫu:
+ Mẫu quercetin chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,02 g quercetin chuẩn hòa tan trong bình định mức 20 ml bằng ethanol tuyệt đối, thu được dung dịch chuẩn gốc quercetin cú nồng độ trong khoảng 1000 àg/ml (dung dịch A). Hỳt 5 ml dung dịch A vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol tuyệt đối đến vạch được dung dịch B. Hút 2 ml dung dịch B vào bình định mức 20 ml; thêm ethanol đến vạch được dung dịch C cú nồng độ quercetin 5 àg/ml.
+ Mẫu thử phytosome quercetin: Hút 5 ml dung dịch A vào bình nón, thêm 0,0117 g HSPC và 20 ml ethanol tuyệt đối. Tiến hành phản ứng tạo phức với thông số nhiệt độ 80oC, thời gian 6 giờ, tốc độ 50 vòng/phút. Hết thời gian phản ứng, toàn bộ dung dịch trong bình nón được đưa vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol tuyệt đối đến vạch được dung dịch D. Hút 2 ml dung dịch D vào bình định mức 20 ml; thêm ethanol đến vạch được dung dịch E chứa phytosome quercetin có nồng độ quercetin toàn phần 5 àg/ml (bằng dung dịch C).
+ Mẫu trắng: chuẩn bị như mẫu thử nhưng không có hoạt chất, thu được dung dịch H.
- Tiến hành quét phổ UV-Vis của dung dịch C, dung dịch E và dung dịch H trong khoảng bước sóng từ 200 đến 600 nm nhằm mục đích lựa chọn bước sóng tại đó quercetin đạt cực đại hấp thu và đánh giá ảnh hưởng của HSPC tới khả năng hấp thụ quang học của quercetin.
40
- Tính thích hợp của hệ thống: Tiến hành đo độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn cú nồng độ 5 àg/ml lặp lại 6 lần. Yờu cầu: Giỏ trị RSD của độ hấp thụ quang phải ≤ 2,0 %.
- Tính tuyến tính: Chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 2
g/ml đến 8 g/ml. Tiến hành đo độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn tại bước sóng đã lựa chọn và xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ quercetin. Yêu cầu: Giá trị R2 ≥ 0,9.
- Độ chính xác: Tiến hành định lượng 6 mẫu thử độc lập. Xác định hàm lượng hoạt chất quercetin có trong các mẫu thử theo phương trình hồi quy tuyến tính. Độ chính xác của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong phytosome quercetin. Yêu cầu RSD ≤ 2,0 %.
- Độ đúng: xác định độ thu hồi, sử dụng phương pháp thêm chuẩn. Thêm một lượng chính xác chất chuẩn quercetin vào trong mẫu thử sao cho nồng độ của quercetin vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Yêu cầu phần trăm tìm lại của các mẫu ở các nồng độ khác nhau nằm trong khoảng từ 98 - 102 %.
2.2.3.2. Phương pháp đánh giá quercetin a) Định lượng
- Hàm lượng quercetin trong nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, với các điều kiện chạy sắc ký đã lựa chọn ở mục 2.2.3.1.a. Mẫu thử được chuẩn bị tương tự như mẫu chuẩn nhưng thay quercetin chuẩn bằng 10 mg quercetin nguyên liệu. Hàm lượng quercetin được tính toán theo công thức:
% Quercetin =
Trong đó: +St, Sc: Diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAU.s) + mc: Khối lượng quercetin chuẩn (mg)
+ mt: Khối lượng quercetin thử (mg) b) Độ tan của quercetin trong các môi trường khác nhau
Tham khảo các nghiên cứu [18], [69] , [116], [125] kết hợp với khảo sát sơ bộ ban đầu, quy trình xác định độ tan của quercetin trong các môi trường khác nhau được thực hiện như sau:
- Cân lượng dư quercetin (với dung dịch nước ở các pH khác nhau: 0,1 g;
cloroform: 0,1 g; ethyl acetat: 1 g) cho vào ống ly tâm dung tích 15 ml chứa 10 ml môi trường thử tạo dung dịch bão hòa.
41
- Lắc liên tục trong bể lắc điều nhiệt WiseBath (Đức) ở nhiệt độ 25 ± 0,5 oC với tốc độ 100 vòng/phút.
- Sau 72 giờ, tiến hành ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 20 phút ở nhiệt độ phòng để loại phần quercetin không tan. Lấy phần dịch phía trên, lọc qua màng ly tâm siêu lọc Amicon Ultra - 4 kDa 7500 vòng trong 3 phút.
- Lấy phần dịch lọc, và tiến hành sắc ký với các điều kiện như trên thu được kết quả là diện tích pic Si - Diện tích pic mẫu thử (mAU.s).
- Xác định nồng độ quercetin (Ci) trong từng môi trường theo phương trình hồi quy tuyến tính mô tả mối tương gian giữa diện tích pic và nồng độ quercetin.
c) Hệ số phân bố dầu nước của quercetin
Dựa trên phương pháp đánh giá hệ số phân bố dầu nước của Andrés A. [22]
và điều kiện thực tế phòng thí nghiệm, quy trình xác định hệ số phân bố log D theo phương pháp lắc được thực hiện như sau:
- Chuẩn bị dung môi: Hai pha n-octanol bão hòa nước và pha nước bão hòa n- octanol được chuẩn bị như sau: Hai ống nghiệm chứa 20 ml n-octanol hoặc dung dịch nước ở các pH khác nhau, thêm 5 ml pha nước hoặc n-octanol tương ứng vào hai ống nghiệm trên. Tiến hành lắc liên tục hỗn hợp dung môi trong bể lắc ở khoảng 25oC với tốc độ 100 vòng/phút trong 24 giờ, để cân bằng trong 12 giờ cho phân tách 2 pha. Thu lấy phần dung môi n-octanol bão hòa nước và pha nước bão hòa n- octanol trong mỗi ống nghiệm.
- Chuẩn bị dung dịch hoạt chất trong pha n-octanol: Hòa tan một lượng quercetin tương ứng với khoảng 0,6 mg/ml quercetin trong pha n-octanol đã bão hòa nước ở các pH khác nhau.
- Phối hợp 5 ml dung dịch hoạt chất trong pha n-octanol và 5 ml dung dịch nước bão hòa n-octanol. Tiến hành khuấy từ trong 24 giờ ở nhiệt độ 25oC với tốc độ khuấy là 150 vòng/phút. Để cân bằng trong 24 giờ tiếp theo cho phân tách hai pha.
Tiến hành định lượng hàm lượng quercetin trong hai pha theo phương pháp HPLC (mô tả ở mục 2.2.3.1). Hệ số phân bố log D của quercetin được tính theo công thức sau:
Log D = Log [ ] [ ]
Trong đó: + [Quercetin]n-octanol: Nồng độ quercetin dạng phân tử trong pha n-octanol.
+ [Quercetin]nước: Nồng độ quercetin (dạng ion hóa và dạng phân tử) trong pha nước ở các pH khác nhau.
42
2.2.3.3. Phương pháp đánh giá phytosome quercetin a) Hình thái tiểu phân
- Sử dụng kính hiển vi điện tử quét SEM.
- Tiến hành:
+ Đối với mẫu bột phytosome quercetin, tiến hành hydrat hóa 0,25 g bột tạo hỗn dịch phytosome quercetin trước khi đo SEM. Quá trình hydrat hóa được thực hiện trong môi trường là 40 ml nước cất ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 1 giờ. Hỗn dịch phytosome thô sau bào chế được làm nhỏ kích thước tiểu phân bằng phương pháp siêu âm trong thời gian 5 phút.
+ Hỗn dịch phytosome quercetin được pha loãng 40 lần, nhỏ trên giấy nhôm.
Để khô bề mặt giấy nhôm ở nhiệt độ phòng, sau đó quan sát mẫu bằng kính hiển vi điện tử FESEM Hitachi S - 4800 có độ phóng đại M = x20 - x800.000; độ phân giải δ = 1,0 nm; điện áp gia tốc U = 0,5 - 30 kV.
b) Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân
- Kích thước tiểu phân phytosome được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS).
- Tiến hành:
+ Đối với mẫu bột phytosome quercetin, tiến hành hydrat hóa trong môi trường nước cất tương tự như khi chụp SEM.
+ Hỗn dịch phytosome quercetin được pha loãng bằng nước cất (đã lọc qua màng celulose acetat 0,2 àm) đến nồng độ hoạt chất sao cho chỉ số đếm (count rates) nằm trong khoảng 200 - 300 kcps. Tiến hành đo mẫu trên máy Zetasizer NanoZS90 - Malvern Instruments, Worcestershire UK (kích thước hạt đo được trong khoảng 0,3 - 10000 nm), sử dụng cuvet nhựa. Hệ số tán xạ ánh sáng của quercetin là 1,47. Ánh sáng tán xạ được đo ở góc 90o. Thiết bị cũng cho giá trị về chỉ số đa phân tán PDI của hệ.
c) Thế Zeta
- Tiến hành tương tự như phương pháp xác định kích thước tiểu phân với cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng với chỉ số đếm nằm trong khoảng 200 - 300 kcps.
d) Định lượng quercetin toàn phần trong phytosome
Hàm lượng quercetin toàn phần trong phytosome được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
- Tiến hành tương tự như mục 2.2.3.1. Chuẩn bị dung dịch thử tương tự như dung dịch chuẩn nhưng thay quercetin chuẩn bằng một lượng bột phytosome quercetin tương ứng với 10 mg quercetin. Đối với mẫu thử là hỗn dịch phytosome
43
quercetin, dung dịch thử được pha như sau: Hút chính xác 1 ml mẫu thử, hòa tan bằng methanol trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích đến vạch. Lọc mẫu qua màng celulose acetat 0,45 àm trước khi tiờm mẫu vào hệ thống sắc ký.
- Hàm lượng quercetin toàn phần trong phytosome được tính toán theo công thức:
CT =
Trong đú: + CT: Nồng độ quercetin trong mẫu thử (àg/ml).
+ St: Diện tích pic mẫu thử (mAU.s).
+ Sc: Diện tích pic mẫu chuẩn (mAU.s).
+ Cc: Nồng độ quercetin trong mẫu chuẩn (àg/ml).
+ k: hệ số pha loãng.
e) Hệ số phân bố dầu nước và độ tan của phytosome quercetin trong các môi trường: Tiến hành tương tự như đối với nguyên liệu quercetin nhưng thay bằng bột phytosome quercetin với khối lượng tương ứng.
f) Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa được xác định theo phương pháp dùng dung môi có tính hòa tan chọn lọc. Dựa vào độ tan của quercetin dihydrat, phytosome quercetin và tham khảo các nghiên cứu đánh giá hiệu suất phytosome hóa của phytosome cao bạch quả [33], phytosome dihydromyricetin [150] hay phức hợp của dịch chiết quả hắc mai biển với phospholipid [131], quy trình đánh giá tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa tiến hành như sau:
Cân lượng bột phytosome tương ứng với khoảng 0,1 g quercetin vào bình định mức 20 ml. Thêm cloroform hoặc ethyl acetat đến vạch lắc đều, sau đó siêu âm trong bể siêu âm với thời gian phù hợp và duy trì nhiệt độ 25oC. Hết thời gian siêu âm, bổ sung cloroform hoặc ethyl acetat đến vạch, lắc đều. Sau đó, lọc qua màng 0,2 àm để loại phần khụng tan, thu lấy dịch lọc. Hỳt chớnh xỏc 1 ml dịch lọc vào cốc có mỏ. Bốc hơi dung môi trong tủ sấy chân không ở 40oC trong 1 giờ. Sau đó, hòa tan lại cắn trong methanol và tiến hành sắc ký HPLC với các điều kiện như mục 2.2.3.1. Hàm lượng quercetin tổng được định lượng bằng cách hòa tan mẫu bột phytosome quercetin (tương ứng 10 mg quercetin) trong methanol, pha loãng, sau đú lọc qua màng celulose acetat 0,45 àm và tiến hành sắc ký với cỏc điều kiện tương tự.
Tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa tính theo công thức:
Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (%) =
Trong đó: + St: Diện tích pic mẫu thử (mAU.s).
+ Sc: Diện tích pic mẫu chuẩn (mAU.s).
44
+ Cc: Nồng độ dung dịch quercetin chuẩn.
+ k: Hệ số pha loãng.
+ m: Khối lượng bột phytosome quercetin.
+ P: Hàm lượng quercetin toàn phần trong bột.
g) Hiệu suất quá trình bào chế
Hiệu suất được đánh giá bằng tỷ lệ giữa khối lượng quercetin tương ứng với khối lượng sản phẩm thu được và khối lượng quercetin ban đầu:
H % =
Trong đó: + msp: Khối lượng quercetin tương ứng có trong khối lượng sản phẩm (g).
+ mbđ: Khối lượng quercetin ban đầu (g).
h) Độ hòa tan của phytosome quercetin
Tham khảo một số tài liệu [125], [131] và qua các khảo sát sơ bộ ban đầu, mức độ và tốc độ hòa tan quercetin từ bột phytosome quercetin được xác định với các điều kiện cụ thể như sau:
- Cân một lượng chính xác mẫu thử tương đương 50 mg quercetin, đưa vào cốc thử hòa tan chứa 900 ml dung dịch acid hydrocloric pH 1,2 có 20 % ethanol (để đảm bảo điều kiện sink), duy trì nhiệt độ môi trường ở 37,0 ± 0,5oC. Thiết bị thử kiểu cánh khuấy với tốc độ khuấy là 100 vòng/phút.
- Hút 5 ml mẫu tại các thời điểm 5 phút, 10 phút, 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ. Mẫu được đưa vào ống ly tâm siêu lọc Amicon 10 kDa, ly tâm 8000 vòng/phút trong thời gian 3 phút. Tiếp theo, bù 5 ml môi trường vào cốc thử hòa tan (môi trường gồm môi trường thử, phần cắn và một phần dịch ly tâm).
Phần dịch trong được định lượng quercetin bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký tương tự như mục 2.2.3.1. Tính toán kết quả bằng cách so sánh trực tiếp với dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ quercetin.
i) Khả năng giải phóng qua màng celulose acetat của phytosome quercetin - Sử dụng thiết bị đánh giá sự giải phóng thuốc qua màng của hãng Hanson Research (dùng bình Franz). Ngăn nhận chứa 7 ml môi trường, ngăn cho là 1 ống trụ tròn, đường kính trong 1 cm, chứa được 1 ml mẫu.
Dựa trên tham khảo tài liệu [99] kết hợp với khảo sát sơ bộ ban đầu, lượng quercetin giải phóng từ hỗn dịch phytosome quercetin trên một đơn vị diện tích theo thời gian được tiến hành như sau:
45 - Điều kiện thử:
+ Màng giải phúng: Màng celulose acetat 0,2 àm.
+ Diện tích bề mặt màng khuếch tán: 1,767 cm2.
+ Môi trường giải phóng: Dung dịch đệm phosphat pH 6,8.
+ Thể tích môi trường có trong ngăn nhận: 7 ml + Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút.
+ Nhiệt độ: 37,0 ± 0,5oC.
+ Mẫu thử: 0,3 ml hỗn dịch phytosome quercetin.
- Tiến hành: Lấy mẫu tại các thời điểm thứ t = 2; 4; 6; 12; 16; 20 giờ. Thể tích mỗi lần lấy mẫu là 1 ml. Lấy mẫu đồng thời với bổ sung môi trường giải phóng vào ngăn nhận với thể tích tương ứng. Mẫu lấy ra được pha loãng đến nồng độ thích hợp.
- Xác định hàm lượng quercetin giải phóng từ hỗn dịch phytosome quercetin.
Lượng quercetin giải phóng từ hỗn dịch phytosome quercetin trên một đơn vị diện tích theo thời gian được định lượng bằng phương pháp HPLC và tính theo công thức:
( ∑
) Trong đó: + Sc: Diện tích pic mẫu chuẩn (mAU.s).
+ Cc: Nồng độ mẫu chuẩn (àg/ml).
+ St: Diện tích pic của mẫu thử tại các thời điểm thứ t (mAU.s)
+ k: Hệ số pha loãng.
+ j: Số điểm lấy mẫu.
+ i: Số thứ tự điểm lấy mẫu.
+ 7: Thể tích môi trường có trong ngăn nhận (ml).
+ 1,767: Diện tích màng giải phóng (cm2).
j) Khả năng tạo phức giữa quercetin và HSPC
- Phytosome quercetin bào chế theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.1.3 được tinh chế loại quercetin tự do dựa trên nguyên tắc: Quercetin tự do tan tốt trong ethyl acetat, phytosome quercetin hầu như không tan trong ethyl acetat.
+ Cân khoảng 4 g bột phytosome vào bình nón, thêm 100 ml ethyl acetat.
Khuấy hồi lưu trong 24 giờ.
+ Để lắng, gạn bỏ phần ethyl acetat phía trên, thêm 100 ml ethyl acetat.
Khuấy hồi lưu trong 24 giờ tiếp theo.