CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xây dựng/thẩm định một số phương pháp đánh giá
3.1.3. Phương pháp xác định tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa
Trước khi lựa chọn phương pháp và xây dựng công thức bào chế phytosome, tiến hành xây dựng quy trình xử lý mẫu trong đánh giá tỷ lệ quercetin phytosome hóa.
Phytosome quercetin được bào chế trên máy cất quay chân không với tỷ lệ quercetin : HSPC là 1:1 (mol:mol). Phản ứng kéo dài trong 6 giờ ở nhiệt độ 80oC, tốc độ phối hợp hoạt chất và PL là 50 vòng/phút. Sau thời gian phản ứng, cất quay chân không trong thời gian 3 giờ ở nhiệt độ 40oC, áp suất 100 mbar để loại dung môi, thu lấy phytosome dạng bột nhão. Sấy khô bột trong tủ sấy chân không ởnhiệt độ 40oC với thời gian 24 giờ để loại hoàn toàn lượng ethanol còn lại.
Nhằm lựa chọn một dung môi hòa tan chọn lọc phù hợp, tiến hành khảo sát độ tan của quercetin, phytosome quercetin trong các dung môi theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.3.2.b và 2.2.3.3.e.
Bảng 3.9. Độ tan của quercetin dạng tự do, dạng phytosome trong cloroform và ethyl acetat (n = 3)
Mẫu Độ tan (àg/ml)*
Dung môi cloroform
Quercetin 2,56 ± 0,10
Phytosome quercetin 33893,55 ± 99,44
Dung môi ethyl acetat
Quercetin 14500,18 ± 62,96
Phytosome quercetin 164,38 ± 1,82
Ghi chú (*): độ tan được tính theo nồng độ quercetin.
62
Số liệu trong bảng 3.9 cho thấy cloroform là dung môi hòa tan chọn lọc phytosome quercetin và ethyl acetat là dung môi hòa tan chọn lọc quercetin dạng tự do. Như vậy, có thể sử dụng hai dung môi này để tách riêng phytosome hoặc quercetin trong hỗn hợp phytosome bào chế, qua đó xác định được hiệu suất phytosome hóa và tinh chế được phytosome quercetin.
Tiến hành theo dõi độ ổn định theo thời gian của quercetin, phytosome quercetin trong hai dung môi được lựa chọn là cloroform, ethyl acetat trong quá trình đánh giá tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Kết quả đánh giá tỷ lệ hoạt chất quercetin phytosome hóa khi sử dụng các dung môi khác nhau theo thời gian (n = 3) Dung môi cloroform Dung môi ethyl acetat Thời điểm (phút) EE (%) Thời điểm (phút) EE (%)
10 69,28 ± 0,44 10 97,53 ± 0,15
30 47,59 ± 0,65 30 97,59 ± 0,20
60 23,08 ± 1,06 60 97,48 ± 0,14
Trong dung môi cloroform: Kết quả quan sát cho thấy sau 10 phút, 30 phút, 60 phút, lượng tủa vàng trong bình định mức tăng dần lên (hình PL 2.3). Kết quả phân tích nhận thấy tại thời điểm 30 phút, 60 phút, tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa tính được nhỏ hơn tại thời điểm 10 phút. Nguyên nhân có thể là do trong dung môi cloroform, phytosome quercetin không bền phân hủy thành quercetin tự do và HSPC, những phân tử quercetin tự do này nhanh chóng kết tập vào các mầm tinh thể quercetin sẵn có trong phytosome (do phản ứng tạo phytosome không hoàn toàn) khiến dung dịch trở nên đục dần theo thời gian. Vì vậy, cloroform không phù hợp để tách riêng phytosome quercetin trong đánh giá tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa Trong dung môi ethyl acetat: Tiến hành so sánh sự khác nhau về tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa tại các thời điểm 10, 30 và 60 phút sau khi hòa tan trong ethyl acetat bằng phương pháp kiểm định t-test. Kết quả thu được cho thấy tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa ở các thời điểm khác nhau không có sự sai khác thống kê (p >
0,01). Do đó, có thể sử dụng ethyl acetat làm dung môi tách riêng quercetin tự do trong đánh giá tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa. Phương pháp này cho kết quả tính hiệu suất ổn định theo thời gian, không có hiện tượng phân hủy phytosome làm tăng nồng độ quercetin tự do trong dung dịch.
Tiến hành khảo sát thời gian xử lý mẫu bột trong dung môi ethyl actetat bằng siêu âm như sau: Cân khoảng 0,4 g quercetin hoặc 0,4 g phytosome quercetin (đã
63
được tinh chế theo mục 2.2.3.3.j) vào bình định mức 20 ml, thêm ethyl acetat đến vạch, lắc đều, sau đó siêu âm trong bể siêu âm ở các thời gian khác nhau (10 phút, 20 phút và 30 phút). Hết thời gian siêu âm, bổ sung ethyl actetat đến vạch, lắc đều.
Sau đú, lọc qua màng 0,2 àm và tiến hành bốc hơi dung mụi trong tủ sấy chõn không. Nồng độ quercetin trong các mẫu được định lượng theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.3.1. Kết quả định lượng nồng độ quercetin trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến nồng độ quercetin trong ethyl acetat (n=3) Thời điểm Nồng độ quercetin tự do
(mg/ml)
Nồng độ quercetin dạng tạo phức (mg/ml)
10 phút 13,213 ± 0,143 0,104 ± 0,002
20 phút 13,592 ± 0,301 0,135 ± 0,002
30 phút 13,631 ± 0,332 0,137 ± 0,004
So sánh nồng độ quercetin tự do trong ethyl acetat ở thời điểm 10 phút với thời điểm 20 phút, và với thời điểm 30 phút bằng phương pháp kiểm định t-test. Kết quả thu được cho thấy nồng độ quercetin tự do trong dung môi ethyl acetat ở các thời gian siêu âm khác nhau không có sự sai khác thống kê (p > 0,01). Bên cạnh đó, nồng độ phytosome quercetin hòa tan trong ethyl acetat sau 10 phút siêu âm là nhỏ nhất. Vì vậy, thời gian siêu âm 10 phút được lựa chọn để xác định tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa.
Từ những kết quả khảo sát ở trên, quy trình xử lý mẫu phytosome quercetin để xác định tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa được tiến hành như sau:
Cân lượng bột phytosome quercetin tương ứng với khoảng 0,1 g quercetin vào bình định mức 20 ml.
Thêm ethyl acetat đến vạch, lắc đều.
Siêu âm trong bể siêu âm trong 10 phút và duy trì nhiệt độ 25oC. Hết thời gian siêu âm, bổ sung ethyl acetat đến vạch, lắc đều.
Lọc qua màng 0,2 àm để loại phần khụng tan, thu lấy dịch lọc. Hỳt chớnh xỏc 1 ml dịch lọc vào cốc có mỏ. Bốc hơi dung môi trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 40oC trong thời gian 1 giờ.
Hòa tan lại cắn trong methanol, pha loãng đến nồng độ thích hợp. Tiến hành định lượng quercetin bằng phương pháp HPLC.
Kết quả khảo sát phương pháp xác định tỷ lệ quercetin được phytosome hóa - Để bước đầu xác định độ chính xác của phương pháp xác định tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa, hỗn dịch sau khi siêu âm 10 phút được tách riêng 2 phần: phần dịch
64
phía trên và phần lắng dưới đáy. Tiến hành bốc hơi dung môi trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 40oC trong thời gian 1 giờ, thu được hai mẫu bột.
Tiến hành đo phổ khối lượng ESI - MS của phần dịch trên theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.3.3.j. Các thông số MS của mẫu phân tích được trình bày ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. Các thông số MS của mẫu phân tích
m/z KLPT xác định từ phổ MS KLPT tra cứu (g/mol) CTPT
303,20 (M-H)+ 302,20 302,23 C15H10O7
Kết quả thu được cho thấy phổ khối của phần dịch phía trên xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 303,20 (M-H)+, tương ứng với công thức phân tử của quercetin (C15H10O7).
Tiến hành đo phổ nhiễu xạ tia X để xác định trạng thái kết tinh của 2 mẫu bột, kết quả được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Giản đồ nhiễu xạ tia X của phần dịch phía trên và phần lắng dưới đáy sau khi siêu âm 10 phút trong dung môi ethyl acetat
Từ giản đồ nhiễu xạ tia X nhận thấy sự khác nhau về mức độ tinh thể của hai mẫu bột. Phần dịch phía trên tồn tại ở dạng kết tinh, trong khi phần lắng dưới đáy tồn tại ở trạng thái vô định hình.
Như vậy, có thể sơ bộ kết luận phần dịch phía trên chủ yếu là quercetin tự do.
- Tiến hành bào chế 3 mẫu phytosome quercetin theo phương pháp bốc hơi dung môi (theo mục 2.2.1.1) với tỷ lệ quercetin : HSPC là 1:1 (mol:mol), nhiệt độ phản ứng là 80oC và tốc độ quay của bình cất quay 50 vòng/phút. Thời gian phối hợp quercetin và HSPC thay đổi ở các mẫu (từ 0,5 giờ đến 2 giờ).
65
Sau khi bào chế được 3 mẫu trên, tiến hành xác định tỷ lệ quercetin được phytosome hóa theo phương pháp đã xây dựng. Độ tan trong nước của mẫu được đánh giá theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.3.3.e. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa và độ tan trong nước của phytosome quercetin tại các thời gian phản ứng khác nhau (n = 3) Thời gian (giờ) EE (%) Độ tan trong nước (àg/ml)
0,5 41,23 ± 0,38 2,94 ± 0,28
1 76,89 ± 0,46 5,88 ± 0,32
2 77,74 ± 0,51 7,46 ± 0,22
Phytosome quercetin tạo thành sẽ cải thiện độ tan của quercetin trong nước.
Tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa càng cao thì độ tan của hỗn hợp càng tăng lên.
Bảng 3.13 cho thấy mối quan hệ thuận chiều giữa tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa, độ tan trong nước của hỗn hợp phytosome thu được và thời gian phản ứng. Như vậy, thông qua kết quả thực nghiệm, có thể sơ bộ kết luận phương pháp xây dựng là phù hợp trong việc xác định tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa.
- Tiến hành đánh giá độ lặp lại của phương pháp thông qua việc xác định hiệu suất 6 lần với một mẫu phytosome quercetin có hàm lượng quercetin toàn phần khoảng 24 %. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ lặp lại
của phương pháp xác định tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa STT Tỷ lệ hoạt chất đƣợc phytosome hóa (%)
1 96,97
2 97,30
3 96,73
4 96,89
5 97,02
6 97,25
TB 97,03
RSD (%) 0,22
Từ bảng 3.14 nhận thấy sai số của phương pháp vẫn nằm trong khoảng chấp nhận được (với giá trị RSD < 2,0 %).
Kết luận: Phương pháp đã xây dựng có thể sử dụng trong việc đánh giá tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa, mặc dù còn phải chấp nhận một số sai số nhất định như sai số hệ thống do tính chọn lọc không hoàn toàn của dung môi. Tuy nhiên, đây là một vấn đề khó giải quyết triệt để, các nhà nghiên cứu vẫn chưa đưa ra được phương pháp nào tối ưu hơn.
66