Việc bào chế các dạng viên chứa phytosome không đòi hỏi công nghệ cao và thiết bị đặc biệt nên dễ dàng áp dụng vào thực tiễn sản xuất. So với viên nén quy ước, viên nang có khả năng giải phóng hoạt chất nhanh do vỏ nang dễ rã và tiểu phân hoạt chất bị nén ít. Do đó, đây là dạng bào chế phù hợp với các hoạt chất có độ tan kém như quercetin. Khi ứng dụng phytosome quercetin vào viên nang thì một vấn đề gặp phải là lượng hoạt chất và tá dược sử dụng lớn, nên việc tạo hạt trước khi tiến hành đóng nang sẽ phù hợp hơn việc đóng bột vào nang. Hạt được bào chế theo phương pháp xát hạt ướt do phương pháp này dễ thực hiện ở cả quy mô nhỏ và quy mô lớn. Đây cũng là phương pháp tạo hạt thông dụng trong các nhà máy sản xuất dược phẩm trong nước hiện nay. Tuy nhiên, phytosome quercetin khá nhạy cảm với nhiệt và ẩm. Chính vì vậy, quá trình bào chế phải được thực hiện trong điều kiện kiểm soát độ ẩm môi trường và nhiệt độ sấy nguyên liệu và cốm phải khống chế dưới 50oC.
144
Một khó khăn lớn trong quá trình nghiên cứu ứng dụng phytosome quercetin vào dạng viên nang là đạt yêu cầu về độ hòa tan. Nguyên nhân chính là do bản thân hoạt chất quercetin hầu như không tan trong nước. Mặc dù sau khi tạo phức với phospholipid, độ tan đã được cải thiện rõ rệt. Tuy nhiên, để đảm bảo chất lượng của viên, một số biện pháp được đưa ra: Về môi trường hòa tan, nghiên cứu đã bổ sung một lượng nhỏ Tween 80 vào môi trường thử độ hòa tan để đảm bảo điều kiện sink.
Về công thức bào chế, lựa chọn các tá dược có khả năng cải thiện độ rã, độ hòa tan hoạt chất từ viên, đồng thời có khả năng hút ẩm tốt.
Lượng quercetin được giải phóng từ viên nang phytosome quercetin phụ thuộc vào thành phần công thức bào chế. Kết quả thực nghiệm (bảng 3.52) cho thấy khi tỷ lệ lactose tăng từ 43 - 49 % thì tốc độ giải phóng hoạt chất tăng từ 74,52 % lên 97,30 %. Nguyên nhân là do lactose có khả năng tạo ra các kênh khuyếch tán, lại dễ tan trong nước nên làm tăng mật độ cũng như kích thước lỗ xốp trong viên, thúc đẩy quá trình hòa tan và khuếch tán hoạt chất từ viên. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng tỷ lệ lactose từ 49 - 53 % thì khả năng giải phóng giảm. Điều này có thể là do lactose khi sử dụng ở tỷ lệ lớn làm cho viên rã chậm, ảnh hưởng đến độ hòa tan của viên. Một thông số quan trọng khác cũng ảnh hưởng đến quá trình hòa tan quercetin là thời gian rã của viên. Rã là bước khởi đầu đặc biệt quan trọng với hoạt chất ít tan như quercetin. Thời gian rã được rút ngắn đồng nghĩa với việc hoạt chất trong viên giải phóng nhanh và mạnh ra môi trường bên ngoài, từ đó giúp hoạt chất tiếp xúc sớm và nhiều hơn với môi trường hòa tan, kết quả cải thiện độ hòa tan, tạo điều kiện cho quá trình hấp thu quercetin về sau. Tuy nhiên, nếu tỷ lệ tá dược rã trong công thức quá thấp thì không đảm bảo khả năng rã của viên do không tạo được mạng lưới vi mao quản dày đặc để hút nước vào trong lòng viên hoặc không trương nở đủ mạnh để gây rã viên. Nhưng nếu tỷ lệ quá lớn thì ảnh hưởng đến khả năng trơn chảy của khối bột. Đó là lý do trong nghiên cứu này ưu tiên sử dụng tá dược siêu rã thân nước natri starch glycolat với hàm lượng thấp 3 - 7 %. Việc sử dụng tá dược này còn giúp hạn chế ảnh hưởng của các tá dược trơn đến độ hòa tan, cũng như làm tăng độ trơn chảy của cốm. Theo kết quả ở bảng 3.54, khi tỷ lệ natri starch glycolat từ 3 - 4,5 % thì khả năng giải phóng tăng. Nguyên nhân là do tá dược này trương nở mạnh, nhanh chóng phá vỡ cấu trúc của viên, giải phóng hoạt chất về dạng tiểu phân ban đầu làm cho bề mặt tiếp xúc của tiểu phân hoạt chất với môi trường hòa tan tăng mạnh. Nếu tỷ lệ từ 4,5 - 6,5 % thì lượng hoạt chất giải phóng không đổi, tỷ lệ natri starch glycolat cao > 7 % thì lượng quercetin giải phóng giảm. Điều này có
145
thể là do natri starch glycolat khi dùng với lượng lớn đã tạo ra lớp hàng rào gel bao xung quanh bề mặt viên khiến các kênh dẫn bị bịt kín, hạn chế sự thấm của môi trường vào viên, đồng thời khả năng hòa tan và khuếch tán hoạt chất ra ngoài chậm.
Ngoài hai tá dược trên, chất diện hoạt Tween 80 cũng ảnh hưởng đến khả năng giải phóng hoạt chất. Theo bảng 3.58, khi nồng độ chất diện hoạt quá cao (> 3 %), độ hòa tan giảm do sự thay đổi hình dạng cấu trúc micell. Ngoài ra, trong quá trình xây dựng công thức nhận thấy khi tỷ lệ Tween 80 tăng thì sẽ gây mùi khó chịu cho chế phầm, đồng thời độ ẩm của cốm bào chế có xu hướng tăng. Có thể sự có mặt của tá dược này đã làm tăng khả năng hút ẩm, giữ nước của cốm.
Phản ứng giữa quercetin và phospholipid được tiến hành trong ethanol tuyệt đối. Do đó, nhằm đảm bảo độ ổn định của phytosome, nghiên cứu lựa chọn dung môi này làm dung môi xát hạt. Ngoài ra, lượng nước trong ethanol sẽ hòa tan một phần natri starch glycolat tạo dịch nhầy liên kết các tiểu phân bột mịn với nhau, nhờ đó hạt được hình thành trong suốt quá trình nhào trộn. Nhưng cần lưu ý ethanol là dung môi dễ bay hơi, do đó trong quá trình bào chế nếu kéo dài thời gian nhào trộn sẽ tạo hạt to, xốp, cứng ảnh hưởng đến chất lượng của cốm và viên nang.
Một điều cần chú ý trong quá trình xây dựng công thức và quy trình bào chế viên nang là phytosome chứa tỷ lệ HSPC khá cao do đó nghiên cứu lựa chọn vỏ nang HPMC. So với nang gelatin, vỏ nang HPMC có ưu điểm là bền về mặt hóa học và nhiệt, ít có tương tác với hoạt chất bên trong và đặc biệt có khả năng chống ẩm tốt nhằm duy trì hàm ẩm của cốm trong khoảng cho phép. Ngoài ra, vỏ nang tan nhanh, ít có có ảnh hưởng đến khả năng giải phóng hoạt chất.
4.4.2. Về phương pháp bào chế
Quá trình bào chế cốm tiến hành thủ công như nghiền bột dùng chày cối, rây qua rây, trộn bột, nhào ẩm, xát hạt và sửa hạt bằng tay, vì vậy các đặc tính của hạt phụ thuộc vào kinh nghiệm người bào chế. Do đặc điểm khối lượng phytosome quercetin trong thành phần công thức viên tương đối lớn nên khi tiến hành trộn bột phải đảm bảo độ đồng đều của khối bột tránh sai số. Tiến hành đóng nang bằng thiết bị đóng nang thủ công, do đó độ trơn chảy của cốm không có ý nghĩa, các viên luôn đảm bảo về khối lượng, nhưng quá trình bào chế viên tốn thời gian, yêu cầu sự tỷ mỉ và chính xác của người bào chế. Trong cùng điều kiện nghiên cứu, các chỉ tiêu chất lượng của hạt và viên nang chứa phytosome quercetin bào chế theo quy trình xây dựng vẫn nằm trong giới hạn yêu cầu. Đặc biệt là khả năng giải phóng hoạt chất quercetin khá đồng đều trong một lô và giữa các lô. Đây là cơ sở trong việc đề xuất
146
xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm. Đồng thời, bước đầu khẳng định quy trình bào chế viên nang phytosome quercetin có đặc điểm thuận lợi cho triển khai sản xuất ở quy mô pilot và quy mô công nghệ. Khi sản xuất ở quy mô lớn hơn, các giai đoạn trong quy trình đều sử dụng máy như trộn nguyên liệu thực hiện trên máy trộn lập phương, xát hạt bằng máy xát hạt hay đóng nang bằng máy đóng nang tự động.
Do đó, các thông số kỹ thuật trong quá trình bào chế như tốc độ và thời gian nhào trộn, tốc độ xát hạt, nhiệt độ và thời gian sấy... phải được kiểm soát chặt chẽ đảm bảo chất lượng viên đồng đều giữa các viên trong một lô hoặc giữa các lô.
4.4.3. Về tiêu chuẩn chất lượng của viên nang chứa phytosome quercetin
Hiện nay, có hai chế phẩm viên nang chứa phytosome quercetin đang được lưu hành trên thị trường là Quercetin phytosome của hãng Thorne và Quercefit của hãng Kenay. Tuy nhiên, các chế phẩm này lưu hành dưới dạng thực phẩm chức năng, do đó các thông tin về bào chế và tác dụng chưa đầy đủ. Trong khi đó, mục tiêu chính của nghiên cứu là chứng minh được ưu điểm của việc tạo phức giữa hoạt chất với phopsholipid so với hoạt chất dạng tự do. Vì vậy, nhằm hạn chế ảnh hưởng của tá dược và quy trình bào chế đến chất lượng của viên nang, nghiên cứu không sử dụng các chế phẩm này làm chế phẩm đối chiếu, mà lựa chọn viên nang quercetin bào chế trong cùng điều kiện với cùng tỷ lệ tá dược làm chế phẩm đối chiếu.
Do trong các dược điển chưa có chuyên luận riêng về dạng phytosome, trên thị trường cũng chưa có viên chứa phytosome quercetin để đối chiếu vì vậy việc đề xuất tiêu chuẩn cho viên nang bào chế chủ yếu căn cứ vào các tài liệu nghiên cứu, tiêu chuẩn chung của viên nang [1], [15], [68] và dựa trên tính lặp lại về các chỉ tiêu chất lượng giữa các mẻ trong cùng điều kiện bào chế (bảng 3.60).
Tỷ lệ phần trăm hoạt chất được phytosome hóa là một trong những chỉ tiêu chất lượng quan trọng của bột phytosome quercetin. Tuy nhiên, phương pháp đánh giá tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa còn chưa được chuẩn hóa. Hơn nữa, mục đích của việc chuyển hoạt chất từ dạng tự do sang dạng phytosome là nhằm cải thiện độ tan và tốc độ hòa tan của hoạt chất, qua đó gia tăng sinh khả dụng của quercetin. Vì vậy, tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa chỉ là một tiêu chí để dự đoán sự gia tăng tốc độ hòa tan quercetin trong môi trường thử nghiệm và xa hơn là trong mô trường dịch sinh học. Chính vì thế, tiêu chí này không được đề xuất cho tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm viên nang chứa phytosome quercetin.
147
So với viên nang chứa quercetin được bào chế với cùng tỷ lệ tá dược, tốc độ phóng thích hoạt chất từ viên chứa phytosome tăng là do tăng diện tích bề mặt tiểu phân, giảm bề dày lớp khuếch tán và tăng độ tan. Với các tiểu phân có kích thước 1 - 2 àm, độ tan tăng khi kớch thước của tiểu phõn giảm. Như vậy, KTTP chỉ là một tiêu chí để dự đoán sự gia tăng tốc độ hòa tan của quercetin trong môi trường thử nghiệm. Nếu muốn đánh giá kích thước của tiểu phân phytosome quercetin trong viên nang thì cần phải dùng các biện pháp đảm bảo loại bỏ hoàn toàn các tá dược.
Bên cạnh đó, phytosome ứng dụng vào viên nang ở dạng bột, nên trước khi đánh giá kích thước cũng phải tìm biện pháp phân tách các tiểu phân. Tham khảo các nghiên cứu, các biện pháp này chưa được chuẩn hóa, và có sự sai lệch giữa các lần đo. Chính vì vậy, nghiên cứu không tiến hành đánh giá kích thước của tiểu phân phytosome sau khi ứng dụng vào viên nang.
Tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm viên nang cứng chứa phytosome quercetin mới chỉ đề xuất cho các mẻ bào chế ở quy mô nhỏ. Do đó, kết quả nghiên cứu chỉ mang tính chất tham khảo cho các nghiên cứu ở quy mô lớn hơn.
4.4.4. Về đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của viên nang cứng chứa phytosome quercetin
So với viên nang chứa 50 mg quercetin, viên nang chứa phytosome quercetin với hàm lượng hoạt chất tương ứng đã thể hiện rõ khả năng bảo vệ gan trên động vật thí nghiệm thông qua việc làm giảm hàm lượng AST, ALT, MDA theo hướng về mức bình thường sau tác động của CCl4. Kết quả này phù hợp với kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của bột phytosome quercetin trong sự so sánh với nguyên liệu quercetin (bảng 3.45 và bảng 3.46). Như vậy, bước đầu có thể chứng minh quy trình bào chế viên không ảnh hưởng tới chất lượng phytosome quercetin bào chế.
4.4.5. Về theo dõi độ ổn định
Mục đích của nghiên cứu độ ổn định là đánh giá sự thay đổi chất lượng của viên nang chứa phytosome quercetin dưới tác động của các yếu tố môi trường cũng như các yếu tố thuộc về chế phẩm làm cơ sở xác định tuổi thọ của viên. Các yếu tố môi trường bao gồm nhiệt độ (ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng phân hủy hoạt chất), độ ẩm (độ ẩm cao thúc đẩy phản ứng thủy phân, thay đổi tính chất lý học của chế phẩm) và ánh sáng (làm hoạt chất phân hủy hoặc chuyển dạng đồng phân). Các yếu tố thuộc về chế phẩm có thể tác động đến độ ổn định bao gồm tính chất lý hóa của hoạt chất và tá dược, dạng bào chế, thành phần công thức, quá trình sản xuất, mức
148
độ kín và bản chất của bao bì đóng gói trực tiếp. Ngoài ra, độ ổn định của các tá dược cũng có thể liên quan đến các phản ứng phân hủy hoạt chất nên cũng cần xem xét.
Nghiên cứu độ ổn định của viên nang chứa phytosome quercetin bào chế được tiến hành trên cơ sở tham khảo các quy định của WHO [134], FDA [43], ICH [57] và hướng dẫn của ASEAN về nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm [24]. Tuy nhiên, do hạn chế về thiết bị đảm bảo điều kiện nghiên cứu nên độ ổn định của viên được nghiên cứu ở hai điều kiện lão hóa cấp tốc (nhiệt độ 40 ± 2oC, độ ẩm 75 ± 5
%) và điều kiện thực (nhiệt độ 15 - 35oC, độ ẩm 60 - 90 %). Về lựa chọn lô thử, nghiên cứu tiến hành trên 3 lô viên nang được bào chế từ 03 lô bột phytosome quercetin. Về bao bì đóng gói, các lô thử nghiệm được đóng trong lọ thủy tinh.
Nghiên cứu lựa chọn bao bì này là do lọ thủy tinh tương đối trơ về mặt hóa học, không thấm ẩm và khí nên phù hợp với các chế phẩm chứa hoạt chất dễ hút ẩm khi tiếp xúc với không khí như phytosome quercetin. Ngoài ra, có thể tiến hành ép vỉ nhôm - nhôm cho viên nang chứa phytosome quercetin. Nhưng do nghiên cứu đang ở bước đầu đánh giá độ ổn định và tiến hành ở quy mô nhỏ nên luận án không nghiên cứu độ ổn định trong bao bì này. Về hàm lượng quercetin toàn phần, mỗi viên nang chứa khoảng 50 mg quercetin, tương ứng với khối lượng bột phytosome khoảng 187,41 mg. So với một số chế phẩm chứa phytosome quercetin trên thị trường (bảng 1.2), hàm lượng quercetin trong mỗi viên nang trong nghiên cứu của luận án thấp hơn. Về các chỉ tiêu chất lượng cần đánh giá, nghiên cứu độ ổn định được tập trung vào hai chỉ tiêu là hàm lượng hoạt chất và độ hòa tan, vì các chỉ tiêu này dễ thay đổi trong quá trình bảo quản và liên quan trực tiếp đến sinh khả dụng của quercetin. Thử nghiệm kết thúc khi độ hòa tan không đạt hay hàm lượng chỉ còn 90 % so với hàm lượng ban đầu.
Từ bảng 3.64, bảng 3.66 nhận thấy trong điều kiện thực, cho đến thời điểm khảo sát 12 tháng, hàm lượng quercetin toàn phần trong viên nang chỉ giảm khoảng 4 % so với giá trị ban đầu. Tốc độ phóng thích hoạt chất của viên nang phytosome quercetin vẫn đạt theo tiêu chuẩn quy định tại các thời điểm khảo sát. Với điều kiện lão hóa cấp tốc, hàm lượng hoạt chất trong viên giảm khoảng 7 - 8 % so với thời điểm bắt đầu thí nghiệm (bảng 3.63). Điều này có thể liên quan đến việc bảo quản mẫu ở điều kiện lão hóa cấp tốc với nhiệt độ bảo quản cao (lên đến 40oC) đã ảnh hưởng đến độ ổn định của hoạt chất. Nhưng do phần lớn hoạt chất đã được bao gói trong phospholipid và các tá dược sử dụng tương đối ổn định do vậy hàm lượng
149
quercetin vẫn duy trì trong giới hạn quy định (90 - 110 %). Do lượng hoạt chất giảm theo thời gian bảo quản nên % quercetin hòa tan có xu hướng giảm (bảng 3.65).
Mặc dù có sự thay đổi đối với các mẫu viên bảo quản ở điều kiện lão hóa cấp tốc, nhưng các chỉ tiêu này vẫn nằm trong tiêu chuẩn cơ sở. Nhận thấy, do thời gian nghiên cứu có hạn, kết quả nghiên cứu độ ổn định thu được trong thời gian ngắn chưa phản ánh được chính xác tuổi thọ thực của chế phẩm. Để hoàn thiện quy trình sản xuất viên nang cứng chứa phytosome quercetin cần có nghiên cứu về độ ổn định trong thời gian dài hơn nhằm đánh giá chính xác độ ổn định và tuổi thọ của chế phẩm.