Mô hình đánh giá hoạt tính in vivo được áp dụng trong nghiên cứu là mô hình gây tổn thương gan bằng CCl4. Có nhiều đường dùng để gây tổn thương gan như đường tiêm màng bụng, đường tiêm dưới da hoặc đường uống. Trong đó, luận án sử dụng đường tiêm màng bụng do khả năng gây tổn thương gan ổn định hơn đường tiêm dưới da và có độ lặp lại cao [59], [90]. Về liều gây độc của CCl4, mức liều dao động trong các nghiên cứu từ 0,02 ml/kg đến 2 ml/kg và có thể dùng đơn liều hoặc đa liều [16]. Nhược điểm khi sử dụng đa liều là tốn thời gian và tổng liều CCl4 rất cao. Vì vậy, nghiên cứu tiến hành gây độc tính gan bằng cách tiêm CCl4 một liều duy nhất với mức liều thấp 0,2 ml/kg nhằm làm giảm thời gian gây độc, giảm mức độ phơi nhiễm CCl4 với môi trường cũng như có thể quan sát được tổn thương gan ở mức độ vừa phải và chuột không chết sau khi gây độc.
Về động vật thí nghiệm, các nghiên cứu đánh giá hoạt tính bảo vệ gan của phytosome quercetin thường thực hiện trên chuột cống Wistar [17] hoặc chuột nhắt BALB/c [14]. So với chuột cống, chuột nhắt thí nghiệm thường có sự đồng nhất giữa cá thể rất lớn về tuổi, chế độ nuôi dưỡng và tình trạng sức khỏe. Chuột nhắt có khối lượng cơ thể nhỏ hơn nhiều so với chuột cống. Bên cạnh đó, theo nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của CCl4 đến các giống chuột khác nhau [26], chuột BALB/c nhạy cảm với tác nhân CCl4 hơn các nhóm chuột khác. Vì vậy, nghiên cứu lựa chọn đối tượng thử là chuột BALB/c.
Về chế độ ăn của chuột thử nghiệm, chế độ ăn cũng ảnh hưởng đến khả năng gây độc gan của CCl4, nhưng tại nồng độ CCl4 cao không có sự khác biệt đáng kể [59]. Do đó, trong suốt quá trình thí nghiệm, chuột được chăm sóc với chế độ bình thường.
Về vị trí lấy máu, với chuột nhắt, vị trí lấy máu có thể ở tĩnh mạch đuôi, hốc mắt hoặc tĩnh mạch cổ. Trong nghiên cứu này, mẫu máu được lấy ở hốc mắt do việc lấy máu tại vị trí này tương đối đơn giản, thao tác nhanh và có thể lấy được thể tích máu lớn đủ để định lượng amino transferase trong thời gian ngắn (10-20 giây). Tại
141
hốc mắt, có thể lấy máu qua một ống mao quản được đưa vào giữa hốc mắt (chếch góc 300 so với mũi) và nhẹ nhàng trượt nhẹ dọc theo nhãn cầu đến vị trí đám rối/xoang hốc mắt.
Về liều dùng, nghiên cứu định hướng bào chế viên nang cứng chứa 50 mg quercetin dạng phytosome. Liều dùng được khuyến cáo là 2 viên/lần x 2 lần/ngày.
Như vậy, tổng lượng quercetin sử dụng trong một ngày là 50 x 4= 200 mg hay 4 mg/kg (giả sử người lớn nặng trung bình 50 kg). Theo hướng dẫn về cách chuyển đổi liều giữa người và động vật thí nghiệm [91], liều trên chuột nhắt = 12 x liều uống ở người = 48 mg/kg. Từ đó, nghiên cứu chọn 2 liều thử nghiệm trên chuột nhắt là 50 mg/kg và 100 mg/kg. Tương tự, Li J. tiến hành đánh giá tác dụng bảo vệ gan của quercetin trên chuột BALB/c ở mức liều 100 mg/kg cân nặng [77]. Trong khi đó, Domitrovic R. và cộng sự [38] sử dụng mức liều 50 mg/kg.
Thời điểm bắt đầu tiến hành tùy theo từng thí nghiệm. Có thể cho uống mẫu trước khi gây độc tính gan bằng CCl4 hoặc sau khi gây độc gan. Với nghiên cứu của luận án, cho chuột uống nước cất, mẫu đối chứng hay mẫu thử trước khi gây độc bằng CCl4 tại ngày thứ 7.
Về thông số đánh giá, khi tế bào gan bị tổn thương do CCl4, nồng độ của hơn 20 enzym trong huyết thanh bị thay đổi, trong đó sự gia tăng nồng độ của AST và ALT có giá trị chẩn đoán hơn cả. Các enzym này xuất hiện trong máu sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng và hết muộn sau khi triệu chứng đã hết. Bên cạnh đó, stress oxy hóa trên gan còn ảnh hưởng đến hàm lượng của các chất chống oxy hóa như glutathione reductase (GSH) và hàm lượng của MDA. Do vậy, luận án lựa chọn các chỉ số AST, ALT, MDA, GSH kết hợp với quan sát đại thể gan chuột để đánh giá khả năng bảo vệ gan của hoạt chất là hoàn toàn phù hợp.
Nghiên cứu sử dụng silymarin là đối chứng dương do chất này được chứng minh có tác dụng bảo vệ và phục hồi tổn thương gan theo cơ chế tăng tạo các cytochrome P450 trong lưới nội bào, ổn định tế bào, ngăn cản quá trình xâm nhập của các chất độc vào bên trong tế bào gan, kích thích sự phát triển của các tế bào gan đã bị hủy hoại, chống peroxyd hóa lipid... [44]. Tham khảo các tài liệu đánh giá khả năng bảo vệ gan của silymarin sau khi gây độc bằng CCl4 [146], mức liều 50 mg/kgP/ngày sử dụng trong nghiên cứu là mức liều phù hợp.
Với nhóm đối chứng bệnh lý, qua quá trình thực nghiệm (bảng 3.44) nhận thấy tiêm CCl4 với mức liều 0,2 ml/kg không ảnh hưởng đến khối lượng cơ thể. Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu năm 2018 [126], CCl4 là tác nhân làm chuột tăng
142
trưởng chậm. Sự sai khác này có lẽ là do ảnh hưởng của nhiều yếu tố như mức liều CCl4, đường đùng để gây tổn thương gan, đặc biệt là thời gian chuột tiếp xúc với tác nhân gây độc. Mặc dù khối lượng cơ thể không tăng nhưng theo bảng 3.47 có hiện tượng gia tăng khối lượng gan do sự xâm nhập của các acid béo và glycerol vào tế bào gan qua màng tế bào bị tổn thương gây ra sự trương phồng tế bào và hoại tử tế bào gan. Những thay đổi này đã được nhiều tác giả báo cáo do tác hại của CCl4 [90], [101]. Ngoài nhóm đối chứng bệnh, thí nghiệm còn thiết kế thêm nhóm đối chứng sinh lý và nhóm chuột uống quercetin với cùng mức liều như phytosome nhằm so sánh tác dụng sinh học của quercetin trước và sau khi tạo phức, qua đó chứng minh khả năng cải thiện hoạt tính bảo vệ gan của phytosome.
Theo nghiên cứu của Gundermann K. J. và cộng sự, khả năng bảo vệ gan của PC được thể hiện ở mức liều từ 525 đến 6000 mg/ngày (trong hầu hết các nghiên cứu, liều dùng dao động từ 1800 - 2700 mg/ngày) [48]. Đó là lý do mà hiện nay các chế phẩm lưu hành trên thị trường như Essentiale forte, PhosChol 565 đều chứa một lượng lớn PC. Trên chuột thí nghiệm bị gây độc bằng CCl4, PC ở mức liều 100 mg/kg có khả năng phục hồi tế bào gan chuột [151]. Như vậy, ngoài vai trò là một giá mang hoạt chất, PC còn có khả năng bảo vệ gan khỏi các tác nhân gây hại. Tuy nhiên, PL chỉ thể hiện hoạt tính khi sử dụng trong một thời gian dài, nên các thử nghiệm thường kéo dài từ 3 tuần cho đến 6 tháng [71]. Với mục đích là chứng minh khả năng cải thiện hoạt tính sinh học của phytosome quercetin, nghiên cứu không thiết kế thêm một lô chuột chỉ uống HSPC nhằm tiết kiệm thời gian và chi phí.
Kết quả nghiên cứu cho thấy sau khi tạo phức với phospholipid, quercetin đã thể hiện rõ khả năng bảo vệ gan trên động vật thí nghiệm ngay ở mức liều thấp 50 mg/kg chuột. Kết quả này được chứng minh thông qua việc làm giảm hàm lượng AST, ALT, MDA và gia tăng hàm lượng GSH trong gan sau tác động của CCl4. Sự sai khác về hoạt tính giữa quercetin dạng tự do và quercetin dạng phytosome có thể là do phytosome quercetin vượt qua rào cản của đường tiêu hóa một cách dễ dàng và được hấp thu nhanh hơn. Ngoài ra, hoạt chất được bảo vệ nên hạn chế sự phân hủy quercetin trong cơ thể. Kết quả thử nghiệm này khá tương đồng với công bố của Abeer I. A. E. F. và cộng sự năm 2017 [17] hay nghiên cứu năm 2018 của Zia O. [152]. Các số liệu thu được còn cho thấy tác dụng bảo vệ gan của quercetin phụ thuộc vào liều sử dụng. Theo bảng 3.45, khi lượng quercetin trong phytosome tăng từ 50 mg lên 100 mg thì ALT giảm từ 230,34 UI/L xuống 104,47 UI/L.
143
Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào chứng minh được hoạt chất vẫn tồn tại ở dạng phytosome sau khi uống. Tuy nhiên, sự cải thiện hoạt tính sinh học của quercetin dạng phytosome so với quercetin dạng tự do đã phần nào chứng minh được sự tồn tại của phytosome quercetin trong hệ tuần hoàn. Hơn nữa, phytosome tăng sinh khả dụng thông qua việc kéo dài thời gian tồn tại của hoạt chất trong cơ thể và hạn chế quá trình chuyển hóa ở gan. Như vậy, thông qua hai thông số này có thể chứng minh hoạt chất khi vào tuần hoàn ở dạng phytosome hay ở dạng tự do.
Theo nghiên cứu của Kunnumakkara A. B. [74], t1/2 của curcumin trong môi trường đệm phopshat pH 7,2 là không quá 10 phút. Trong khi, với chế phẩm Meriva, vẫn còn 82 % hoạt chất không bị biến đổi sau 240 phút ở cùng pH này. Như vậy, để có thể ổn định lâu dài trong hệ tuần hoàn, curcumin phải tồn tại ở dạng phytosome.
Trong một nghiên cứu khác đánh giá quá trình chuyển hóa ở gan chuột Wistar nhận thấy curcumin ở dạng tự do hay dạng phytosome đều bị giáng hóa ở gan, nhưng do curcumin dạng phytosome đạt được sự cân bằng dầu - nước tốt hơn curcumin tự do nên một lượng lớn phytosome qua thành ruột non trong khi enzym xúc tác cho chuyển hóa ở gan lại có tính bão hòa nên lượng curcumin dạng phytosome mất mát không đáng kể so với curcumin dạng tự do, kết quả nồng độ curcumin trong huyết tương của nhóm uống phytosome gấp 20 lần so với nhóm uống curcumin với mức liều 340 mg/kg [128].