4.1. Về xây dựng công thức và quy trình bào chế phytosome quercetin
4.1.2. Về công thức bào chế
- Dung môi là môi trường cho quá trình hình thành liên kết giữa hoạt chất và phospholipid. Vì vậy, yêu cầu của dung môi là hòa tan tốt hoạt chất và phospholipid.
Ngoài ra, dung môi cũng cần dễ bay hơi để có thể loại nhanh và hoàn toàn khi hút chân không. Trong những nghiên cứu đầu tiên về phytosome như phytosome rutin (2012) [117], phytosome quercetin (2014) [100] ..., hỗn hợp dung môi thường được sử dụng là methanol : dicloromethan. Do đó, trong giai đoạn đầu thực hiện luận án, quercetin và phospholipid được hòa tan trong hỗn hợp dung môi methanol : dicloromethan (tỷ lệ 2:3 tt/tt) [13]. Tuy nhiên, muốn ứng dụng vào thực tế thì cần cân nhắc đến độc tính và tồn dư dung môi sử dụng nên hiện nay các nghiên cứu bào chế
123
phytosome đang hướng tới sử dụng các dung môi xanh thân thiện với môi trường như ethanol. Trong quá trình thực nghiệm, luận án đã tiến hành đánh giá độ tan của quercetin trong ethanol tuyệt đối ở nhiệt độ 25oC, kết quả cho thấy quercetin tan trong ethanol với độ tan 2,92 mg/ml, đồng thời phospholipid cũng hòa tan tốt trong dung môi này. Bên cạnh đó, so với methanol, ethanol có hằng số điện môi thấp hơn (Hằng số điện môi của methanol và ethanol ở nhiệt độ 20oC lần lượt là 33,30 và 25,02) [87], nên sẽ hạn chế sự trao đổi proton giữa dung môi và phospholipid. Tóm lại, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng tạo phức xảy ra đồng thời tăng khả năng ứng dụng phytosome trên lâm sàng, ethanol tuyệt đối được lựa chọn làm dung môi trong nghiên cứu này. Thực tế, khi tiến hành bào chế phytosome quercetin ở quy mô nhỏ và quy mô 500 g/mẻ, quercetin và phospholipid tan hoàn toàn trong ethanol. Điều này được thể hiện qua tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa trên 90 % (hình 3.4 và bảng 3.40). Đây cũng là dung môi được sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu bào chế phytosome hiện nay như phytosome epigallocatechin gallate (2015) [136], phytosome silymarin (2016) [83] hay phytosome acid oleanolic (2016) [149].
- Phospholipid: Trong quá trình phát triển các chế phẩm chứa phytosome gặp một số khó khăn nhất định, xuất phát từ PL: Nguồn nguyên liệu để chiết tách PL từ tự nhiên hoặc tổng hợp rất dồi dào, tuy nhiên so với nhiều loại tá dược khác giá thành vẫn còn khá cao, gây khó khăn khi ứng dụng vào các sản phẩm trên lâm sàng.
Trong những năm trở lại đây, quy trình tách chiết PL có độ tinh khiết cao từ các nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có trong nước như nội tạng động vật [7], lòng đỏ trứng gà [12] đã bắt đầu được tập trung nghiên cứu. Điều này sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển các hệ mang thuốc có cấu trúc mô phỏng màng tế bào sinh học như phytosome. Luận án tiến hành khảo sát hai loại phospholipid hay sử dụng trong các nghiên cứu bào chế phytosome hiện nay là lecithin và HSPC. Sau khi tiến hành đánh giá một số đặc tính của phytosome quercetin bào chế với cả hai nguyên liệu nhận thấy phytosome bào chế với HSPC thể hiện tính ổn định vật lý hơn. Theo bảng 3.20, độ tan trong nước và tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa thay đổi không đáng kể sau 1 tháng bảo quản ở điều kiện thực và điều kiện lão hóa cấp tốc. Trong khi đó, hai chỉ tiêu này có xu hướng giảm theo thời gian với phytosome bào chế với lecithin. Nguyên nhân là do so với lecithin, HSPC sử dụng trong nghiên cứu tinh khiết hơn về mặt thành phần, và bền về mặt hóa học hơn, do hạn chế quá trình peroxyd hóa các gốc acid béo chưa no, từ đó giúp màng lipid bền vững, hạn chế được quá trình rò rỉ hoạt chất vào môi trường bên ngoài. Bên cạnh đó, HSPC tồn tại
124
ở dạng bột, thích hợp khi ứng dụng vào dạng viên so với trạng thái dẻo dính của lecithin [53]. Ngoài HSPC, năm 2016, Nagpal N. và cộng sự [89] đã sử dụng thêm cholesterol khi tiến hành bào chế phytosome tecomella undulate. Phytosome thu được có dạng túi hình cầu, nhỏ, đơn lớp với KTTP 153,2 nm; thế Zeta đạt -23,5 mV; hiệu suất phytosome hóa trên 90 % và sau 12 giờ giải phóng được 89,7 % hoạt chất. Nhận thấy vai trò của cholesterol, luận án quyết định đưa tá dược này vào công thức bào chế phytosome. Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.22 cho thấy các đặc tính như KTTP, phân bố KTTP, thế Zeta và tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa không bị ảnh hưởng nhiều khi tỷ lệ quercetin:HSPC:cholesterol (mol:mol:mol) là 1:1:0,1 hay 1:1:0,2. Nghiên cứu của Rasaie S. và cộng sự [100] cũng cho kết quả tương tự, với tỷ lệ quercetin:PC:cholesterol là 1:2:0,2, các thông số trên thay đổi nhưng không quá lớn so với mẫu không có cholesterol. Tuy nhiên, sự có mặt của cholesterol sẽ góp phần gia tăng độ ổn định vật lý của hỗn dịch phytosome bào chế.
Sau 2 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC, hỗn dịch vẫn đồng nhất, không xuất hiện kết tủa lớn có thể quan sát bằng mắt thường, KTTP dao động trong khoảng hẹp (bảng 3.23). Độ ổn định được cải thiện có thể là do sự hình thành liên kết hydro giữa nhóm hydroxyl ở vị trí carbon số 3 của cholesterol với nhóm carbonyl của HSPC. Liên kết này giúp tăng cường lực đẩy tĩnh điện giữa các lớp PL kép ở trên bề mặt và nhờ đó làm tăng độ ổn định của phytosome, do hạn chế được sự di chuyển của chuỗi acyl trong phân tử PL [92]. Mức độ cải thiện độ ổn định của hỗn dịch phytosome bào chế có thể được khẳng định khi một số nghiên cứu cho thấy hỗn dịch phytosome không chứa cholesterol chỉ có thể ổn định trong vòng 21 ngày khi theo dõi ở điều kiện phòng thí nghiệm (sau 7 ngày, KTTP đã tăng gấp 6 lần so với ban đầu) [100]. Nhằm đảm bảo độ ổn định và sự bền vững của lớp màng phytosome, cholesterol chỉ dùng với một lượng vừa đủ, khi sử dụng quá nhiều có thể gây ra tương tác bất lợi với các thành phần khác của phytosome, qua đó làm giảm chất lượng phytosome bào chế và rút ngắn tuổi thọ của chế phẩm. Quá trình thực nghiệm nhận thấy phytosome bào chế với tỷ lệ quercetin:HSPC:cholesterol là 1:1:0,5 có KTTP > 500 nm và tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa chỉ đạt 71,94 ± 0,45 % (hình 3.7). Theo nghiên cứu của Rasaie S. [100], KTTP tăng từ 79,67 ± 1,53 nm lên 393,67 ± 2,89 nm khi tăng tỷ lệ cholesterol trong công thức.
Một điều cần lưu ý khi sử dụng phospholipid: HSPC nói riêng và phospholipid nói chung đều yêu cầu điều kiện bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh (5 ± 3oC), vì vậy
125
trong quá trình bào chế, một thao tác rất quan trọng là cân bằng với nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm trước khi cân để không ảnh hưởng tới chất lượng của nguyên liệu.
- Tỷ lệ quercetin : HSPC là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng của phytosome tạo thành. Tùy theo độ tinh khiết của nguyên liệu và tỷ lệ PC trong PL sử dụng mà tỷ lệ này khác nhau giữa các nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ quercetin và HSPC được khảo sát từ 0,7 đến 2,0 (mol) tương tự nghiên cứu của Vankudri R. [125]. Thông qua bảng so sánh một số đặc điểm của phytosome bào chế với các tỷ lệ quercetin:HSPC khác nhau (bảng 3.21), tỷ lệ 1:1 (mol:mol). Đây cũng là cũng là tỷ lệ tối ưu trong báo cáo của nhiều nghiên cứu bào chế phytosome của các hoạt chất nhóm flavonoid như rutin [35], silybin [120] hay quercetin [116]...
Như vậy, trong nghiên cứu này, phytosome quercetin được bào chế từ bột quercetin dihydrat, HSPC và cholesterol. So với sản phẩm quercetin phytosome của Thorne Research, sử dụng dịch chiết cây Hòe - Sophora japonica L. và hỗn hợp PC hướng dương thì nghiên cứu sử dụng nguyên liệu tinh khiết hơn, có sự kết hợp giữa các PL, do đó có thể tăng hiệu suất và độ ổn định của phytosome tạo thành.