4.1. Về xây dựng công thức và quy trình bào chế phytosome quercetin
4.1.5. Về phương pháp đánh giá một số đặc tính của phytosome quercetin
Các đặc tính vật lý của phytosome đặc trưng bởi hình thái, kích thước, thế Zeta và khả năng giải phóng hoạt chất. Đặc tính hóa học được đánh giá là hàm lượng hoạt chất, tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa, độ ổn định (khả năng rò rỉ hoạt chất trong quá trình bảo quản). Các đặc tính hóa, lý đều ảnh hưởng tới tác dụng sinh học của phytosome.
Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân và thế Zeta
Kích thước là một trong những tính chất quan trọng cần khảo sát do có ảnh hưởng đến độ tan, tốc độ hòa tan, độ bền của hệ tiểu phân hay là tác nhân định vị tiểu phân trong hệ tuần hoàn... Đặc tính này có thể được xác định bằng nhiều kỹ
128
thuật phân tích khác nhau như rây, quan sát với kính hiển vi quang học, đo tốc độ lắng đọng, lọc, quan sát với kính hiển vi điện tử, tán xạ ánh sáng động hay nhiễu xạ lase. Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm khác nhau, thường dựa vào kích thước tiểu phân của mẫu để lựa chọn phương pháp phù hợp [139]. Tham khảo các nghiên cứu về phytosome [15], [144] nhận thấy một trong những kỹ thuật được sử dụng phổ biến để đánh giá kích thước tiểu phân phytosome là tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS). DLS phân tích cường độ dao động theo thời gian của tia sáng được tạo thành từ chuyển động Brown của tiểu phân có kích thước nhỏ hơn bước sóng của tia tới ở góc tới xác định. Cường độ khuếch tán phụ thuộc vào kích thước tiểu phân. Tiểu phân nhỏ di chuyển nhanh do chúng có hệ số khuếch tán cao, trong khi tiểu phân lớn hơn di chuyển chậm, cường độ dao động thấp hơn.
Từ đường cong biểu diễn cường độ khuếch tán theo thời gian sẽ cho các thông tin về KTTP và hệ số đa phân tán PDI [94]. So với các phương pháp khác, phương pháp này có ưu điểm là dễ tiến hành, không cần công đoạn xử lý mẫu phức tạp như các phương pháp hiển vi điện tử, thời gian cần thiết để đo mẫu không dài và độ lặp lại kết quả tương đối tốt. Từ những phân tích trên và căn cứ với điều kiện trang thiết bị hiện có, luận án lựa chọn DLS là phương pháp xác định kích thước của tiểu phân phytosome quercetin bào chế.
Về quy trình chuẩn bị mẫu, bột phytosome quercetin được tiến hành hydrat hóa trong môi trường nước tạo hỗn dịch trước khi đo. Do đó, mẫu thử được chuẩn bị bằng cách pha loãng hỗn dịch trong nước. Trong nghiên cứu này, sử dụng nước cất 2 lần đó lọc qua màng celulose acetat 0,2 àm nhằm hạn chế ảnh hưởng của cỏc tạp chất đến kết quả đo. Ngoài ra, trong quá trình xử lý mẫu cũng cần đảm bảo dụng cụ thí nghiệm phải sạch. Độ chính xác và độ lặp lại của kết quả đo bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố như khoảng phân bố KTTP của hệ, độ nhớt, count rate... Count rate là đại lượng chỉ số lượng photon đến detector trong một giây, đặc trưng cho nồng độ các tiểu phân trong hệ, hay đặc trưng cho tỷ lệ pha loãng mẫu [94]. Dựa trên kết quả khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của mức độ pha loãng đến kết quả xác định kích thước, yêu cầu count rate nằm trong khoảng 200 - 300 kcps. Nếu tốc độ đếm tiểu phân quá thấp, độ tin cậy của kết quả đo KTTP thấp. Nguyên nhân có thể là do khi nồng độ các tiểu phân quá loãng thì mật độ các hạt trong một đơn vị thể tích giảm, các hạt có xu hướng dao động mạnh làm sai lệch phép đo tán xạ ánh sáng động dẫn đến kết quả kích thước hạt thu được lớn hơn so với các mẫu có count rate nằm trong khoảng 200 - 300 kcps. Ngược lại, đối với hỗn dịch có nồng độ các tiểu phân cao thì dẫn đến hiện
129
tượng ánh sáng bị đa tán xạ (phản xạ, khúc xạ), ánh sáng tán xạ từ một hạt tương tác với một hạt khác trước khi đến đầu dò và bị giảm cường độ, kết quả kích thước hạt thu được nhỏ hơn so với các mẫu có count rate nằm trong khoảng 200 - 300 kcps.
Năm 2014, Rasaie S. và cộng sự [100] tiến hành bào chế phytosome quercetin theo phương pháp bốc hơi dung môi với tỷ lệ quercetin:PC:cholesterol (mol:mol:mol) là 1:2:0,2. Thực nghiệm cho thấy tiểu phân phytosome có kích thước xác định theo phương pháp DLS là 83,33 ± 2,89 nm. Trong khi theo nghiên cứu của Yahdiana H. và cộng sự [138], kích thước của phytosome quercetin bào chế theo phương pháp và công thức như trên là 266,6 ± 1,37 nm. Sự khác nhau về KTTP giữa hai nghiên cứu này có thể là do ảnh hưởng của thông số quang học lựa chọn, thiết bị sử dụng, quy trình xử lý mẫu trước khi đo, hay phụ thuộc vào cách xử lý kết quả. Kết quả xác định KTTP có thể biểu diễn dưới dạng phân bố KTTP theo thể tích (volume distribution), theo số lượng (number distribution) hay theo diện tích pic (intensity distribution). Nghiên cứu của Rasaie S. biểu diễn kích thước theo thể tích.
Đây là sự lựa chọn phù hợp vì đặc tính nhạy với sự có mặt của các tiểu phân kích thước lớn trong mẫu và cho biết có bất kỳ tiểu phân có kích thước lớn nào tồn tại trong hỗn dịch phytosome thậm chí khi số lượng tiểu phân nhỏ, nhưng khối lượng của các tiểu phân cũng tương đối lớn. Điều này lý giải tại sao kết quả nghiên cứu về KTTP của Rasaie S. phù hợp với nghiên cứu của Abeer I. A. E. F. năm 2017 [17], tiểu phân thu được có kích thước 70 ± 7,44 nm.
So với các nghiên cứu khác, KTTP của phytosome quercetin bào chế theo các thông số và quy trình đã lựa chọn vẫn tương đối lớn trong khoảng 350 - 400 nm.
Nguyên nhân là do sự khác nhau về kích thước giữa việc hydrat bột phytosome ngoài bình cất quay và việc hydrat hóa từ màng film. Bên cạnh đó, do định hướng ứng dụng phytosome quercetin vào dạng viên nên bào chế phytosome dưới dạng bột sẽ phù hợp hơn dạng hỗn dịch. Vì vậy, luận án không đi sâu nghiên cứu phối hợp các phương pháp giảm kích thước tiểu phân, chỉ sử dụng phương pháp siêu âm.
Theo kết quả của các nghiên cứu ban đầu về phytosome quercetin [13], PL 3 và PL 4, kích thước và phân bố kích thước của các tiểu phân phytosome quercetin phụ thuộc vào thời gian siêu âm. Độ giảm kích thước tiểu phân tỷ lệ thuận với thời gian siêu âm. Thời gian siêu âm càng lâu thì năng lượng sóng siêu âm tác động vào tiểu phân phytosome càng lớn dẫn tới kích thước của phytosome càng giảm và hệ càng đồng nhất hơn (chỉ số đa phân tán giảm). Tuy nhiên, nếu siêu âm trong thời gian quá lâu có thể khiến hệ bị quá nhiệt ảnh hưởng tới độ ổn định của phytosome bào
130
chế. Trong quy trình bào chế phytosome quercetin ở quy mô nhỏ chỉ tiến hành khảo sát lựa chọn thông số kỹ thuật là thời gian siêu âm do các thiết bị siêu âm hiện có trên thị trường hiện nay chỉ có một tần số và biên độ dao động nhất định, chưa có thiết bị có thể thay đổi được tần số siêu âm. Với điều kiện nghiên cứu, hỗn dịch phytosome quercetin được làm giảm KTTP bằng phương pháp siêu âm với tần số 50 Hz và công suất 60 W. Trong khi các nghiên cứu khác [100] làm giảm kích thước bằng cách kết hợp siêu âm bể, đồng nhất hóa áp suất cao và siêu âm đầu dò.
Ngoài ra, quy mô bào chế cũng ảnh hưởng đến kết quả xác định KTTP. Tuy nhiên, với kích thước dưới 500 nm, phytosome quercetin bào chế vẫn có khả năng cải thiện độ tan và tốc độ hòa tan của hoạt chất, hướng tới cải thiện hoạt tính sinh học của quercetin một cách hiệu quả. Điều này có thể được chứng minh từ kết quả ở bảng 3.29 và bảng 3.30 của luận án, hay trong một nghiên cứu về phytosome diosmin, với KTTP là 316 ± 2,45 nm và giá trị PDI là 0,50 ± 0,01; phytosome vẫn có khả năng tăng hấp thu hoạt chất qua đường tiêu hóa thông qua cải thiện độ tan và tốc độ hòa tan [144]. Trong một nghiên cứu khác, phytosome bào chế với kích thước 1202 ± 3,23 nm có khả năng làm tăng tính thấm qua da chuột thực nghiệm lên 2,6 lần so với rutin (44 ± 1,52 % so với 17 ± 1,06 %) [35].
Kết quả nghiên cứu còn cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về KTTP khi tăng quy mô bào chế phytosome quercetin từ 5 g/mẻ lên 500 g/mẻ, điều đó thể hiện sự ổn định và đồng nhất về KTTP giữa các lần bào chế.
Ngoài đánh giá bằng DLS, một số nghiên cứu [15], [17] còn xác định KTTP theo kính hiển vi điện tử quét SEM hoặc kính hiển vi điện tử truyền qua TEM. Khi đánh giá KTTP bằng TEM gặp một số khó khăn nhất định do thiết bị hiện đại nên chi phí thực nghiệm cao, đồng thời đòi hỏi các điều kiện làm việc khắc nghiệt như thiết bị phải hoạt động ở chân không siêu cao, ổn định về điện và nhiều phụ kiện đi kèm. Bên cạnh đó, quá trình xử lý mẫu phức tạp và các thao tác điều khiển TEM đòi hỏi độ chính xác cao [40]. Với mục đích sử dụng hình ảnh từ kính hiển vi điện tử làm chỉ tiêu so sánh giữa các mẫu phytosome khác nhau cũng như để kiểm tra và so sánh với kết quả thu được từ DLS, trong nghiên cứu này SEM phù hợp hơn TEM.
Theo kết quả từ SEM (hình 3.14), tiểu phân phytosome có kích thước khoảng 400 nm. Trong khi, kích thước xác định theo phương pháp DLS cao hơn khoảng 450 nm (bảng 3.29). Sự khác nhau này là do SEM đánh giá KTTP khi mẫu ở trạng thái khô, còn DLS xác định kích thước của tiểu phân trong môi trường nước nên kết quả đánh giá kích thước bị ảnh hưởng của môi trường phân tán. Kích thước tiểu phân đo bằng
131
DLS thường cao hơn so với SEM. Trong một nghiên cứu đánh giá KTTP của poly (alkylcyanoacrylate), nếu sử dụng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động, KTTP xác định là 199 nm cao hơn so với kết quả thu được từ SEM là 167 nm [130]. Tương tự, theo nghiên cứu của Verma P. (2018), KTTP được đánh giá theo DLS và SEM lần lượt là 178 nm và 74,29 nm [127].
Khi đưa giá trị KTTP, một thông số quan trọng đi kèm là hệ số đa phân tán PDI. Giá trị PDI cho biết độ ổn định vật lý của hỗn dịch phytosome và hệ số này càng thấp càng tốt. Với PDI quá lớn, gần bằng 1, thể hiện mẫu có chứa nhiều tiểu phân kích thước lớn và không phù hợp đánh giá kích thước bằng DLS. Với nghiên cứu này, giá trị PDI < 0,4 cho thấy các tiểu phân phytosome quercetin bào chế có sự đồng nhất về mặt kích thước, qua đó đảm bảo độ ổn định cao của hệ.
Hỗn dịch phytosome bào chế có giá trị tuyệt đối thế Zeta > 20 mV, nhờ đó tương tác tĩnh điện giữa các tiểu phân tăng góp phần chống kết tụ tiểu phân trong quá trình bảo quản. Thế Zeta của hỗn dịch phytosome mang giá trị âm do nhóm phosphat của HSPC trong môi trường nước có pH trung tính, phản ánh phân tử quercetin được liên kết và bao quanh bởi đuôi hydrocarbon của PL. Theo bảng 3.21, thế Zeta có xu hướng tăng khi tỷ lệ HSPC tăng.
Hình thái của tiểu phân
Về xử lý mẫu, SEM duy trì hoạt động trong chân không nên mẫu cần được làm khô ở nhiệt độ phòng. Trước khi đo, một số các mẫu được phủ bởi một lớp mỏng các vật liệu dẫn điện như carbon, vàng, hợp kim hay kim loại khác. Carbon là màng bao dẫn điện phổ biến nhất trong phân tích nguyên tố, trong khi đó màng bao kim loại như vàng hoặc plastin lại có hiệu quả nhất trong các ứng dụng chụp ảnh điện tử có độ phân giải cao [40]. Điều này lý giải tại sao hình ảnh của mẫu nghiên cứu không được sắc nét, trong các nghiên cứu tiếp theo, luận án sẽ tiến hành chụp lại các tiểu phân phytosome quercetin được bao lớp plastin.
Hình ảnh SEM của tiểu phân phytosome quercetin trong bột bào chế (hình 3.14) ở dạng hình cầu, đồng nhất và không có sự xuất hiện của tinh thể hình đa giác như mẫu nguyên liệu quercetin ban đầu cũng như không có sự hiện diện của các cấu trúc khác. Kết quả thu được tương tự như như nghiên cứu của Abeer I. A. E. F.
[17], Singh D. [116], Vankudri R. [125], ... Kết quả này cũng góp phần chứng minh quercetin mất cấu trúc tinh thể khi liên kết với HSPC, phù hợp với kết quả phân tích phổ nhiễu xạ tia X và phổ phân tích nhiệt quét vi sai DSC.
132
Độ tan của hoạt chất
Nhằm đánh giá độ tan của quercetin dạng tự do hay quercetin dạng phytosome trong các môi trường khác nhau, nghiên cứu tiến hành khuấy đến bão hòa một lượng quercetin ở nhiệt độ 25oC. Các tiểu phân quercetin chưa tan được loại bỏ bằng phương pháp siêu ly tâm. Nghiên cứu không áp dụng phương pháp lọc để tách loại tiểu phân vì ở giai đoạn đầu lượng tiểu phân lớn, khi tiến hành lọc qua màng lọc sẽ gây bít kín lỗ lọc, hệ quả là phải sử dụng nhiều màng lọc trong mỗi lần thí nghiệm, nhưng khả năng lọc không cao. Ngoài ra, quercetin là hoạt chất có màu nên sau mỗi lần lọc phải tiến hành xử lý màng lọc. Với phương pháp siêu ly tâm, quá trình tách loại tiểu phân phụ thuộc vào khối lượng tiểu phân trong dịch ly tâm, tốc độ và thời gian cần thiết để các tiểu phân sa lắng hoàn toàn. Vì vậy, thời gian ly tâm phải đủ dài. Tham khảo các tài liệu nước ngoài [116], [125] và dựa trên kết quả khảo sát sơ bộ, nghiên cứu lựa chọn thời gian ly tâm là 20 phút và tốc độ ly tâm là 6000 vòng/phút. Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng phương pháp siêu ly tâm khó đảm bảo tách loại hoàn toàn các tiểu phân hoạt chất ở kích thước cỡ nano. Nhằm đảm bảo độ tin cậy của kết quả thu được, nghiên cứu kết hợp với phương pháp lọc. Luận án sử dụng màng ly tâm siêu lọc Amicon Ultra - 4 kDa thay vì sử dụng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,2 àm nhằm tăng hiệu quả trong việc lọc cỏc tiểu phõn chưa hũa tan. Kết quả thực nghiệm cho thấy việc kết hợp hai phương pháp cho dịch lọc trong. Tiến hành đo kích thước tiểu phân của dịch lọc bằng máy Zetasizer ZS 90 với curvet thạch anh, kết quả không tìm thấy tiểu phân trong dung dịch đo, count rate thấp.
Quercetin được xếp vào nhóm II trong bảng phân loại sinh dược học bào chế (BCS) [79]. Kết quả đánh giá độ tan ở bảng 3.30 cũng thể hiện đặc tính rất khó tan trong nước của quercetin (0,85 àg/ml), đặc biệt trong mụi trường cú pH 1,2. Vỡ vậy, khi đưa vào dạng viên, sinh khả dụng của quercetin không đạt mức độ cần thiết do hoạt chất hòa tan chậm, nên nồng độ hoạt chất trong máu tăng chậm, thậm chí không đạt được nồng độ đủ để gây hiệu quả trên lâm sàng. Độ tan của hoạt chất phụ thuộc vào đặc tính lý hóa của hoạt chất, môi trường hòa tan và nhiệt độ. Tuy nhiên, điều này chỉ đúng với các tiểu phân có kích thước cỡ vài micromet. Với các tiểu phõn hoạt chất cú kớch thước nhỏ hơn 1 - 2 àm, độ tan phụ thuộc vào KTTP. Độ tan tăng lên khi KTTP giảm xuống dưới 1000 nm [62]. Điều này giải thích lý do tại sao sau khi tạo phức với PL, độ tan trong nước của quercetin đã được cải thiện đáng kể (gấp 10 lần so với nguyên liệu quercetin ban đầu), kết quả đánh giá được thể hiện ở bảng 3.30. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Singh D. và cộng sự [116], ở
133
nhiệt độ 25oC, độ tan trong nước của phytosome (tỷ lệ quercetin: PC là 1:1) tăng 11 lần so với quercetin dạng tự do. Ngoài gia tăng độ tan trong nước, nghiên cứu của Riva A. và cộng sự [102] còn chứng minh khả năng cải thiện độ tan của phytosome quercetin trong dịch dạ dày trạng thái đói pH 1,6; dịch ruột ở trạng thái đói pH 6,5 và dịch ruột ở trạng thái no pH 5,0.
Hệ số phân bố dầu - nước
Một thông số quan trọng để đánh giá ý nghĩa của việc bào chế phytosome là hệ số phân bố dầu - nước. Cấu trúc của quercetin có năm nhóm -OH phenol, đây là những trung tâm ion hóa phụ thuộc vào pH môi trường [105]. Vì vậy, nghiên cứu lựa chọn đánh giá hệ số phân bố log D (hệ số phân bố dầu - nước ở các pH khác nhau) thay cho log P (hệ số phân bố dầu - nước ở pH trung tính). Hệ số log D dùng để đánh giá sự cân bằng giữa mức độ thân dầu và mức độ thân nước của các chất, do đó thông số này sẽ ảnh hưởng tới độ tan, tính thấm, qua đó ảnh hưởng đến khả năng hấp thu của hoạt chất. Theo Kwon Y. [75], những hoạt chất có log D từ 0 đến 3 sẽ có sự cân bằng tốt giữa độ tan và tính thấm, đây là giá trị phù hợp đảm bảo cho hoạt chất có thể hấp thu tốt qua đường tiêu hóa. Hoạt chất muốn thấm qua hàng rào máu não cần có giá trị log D khoảng 2. Hoạt chất có log D < 0 thường tan tốt trong môi trường nước nhưng khó thấm qua đường tiêu hóa hoặc qua hàng rào máu não.
Với giá trị log D > 5, hoạt chất sẽ có vấn đề trong chuyển hóa, hoạt chất thường liên kết mạnh với albumin trong huyết tương và độ tan trong nước thấp, kết quả khả năng hấp thu qua đường uống thấp và dao động giữa các cá thể sau khi uống.
Phương pháp phổ biến để xác định hệ số phân bố log D là phương pháp lắc (shake flask method). Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp để đánh giá các hoạt chất có giá trị log D trong khoảng -2 đến 4 [93].
Theo BCS, quercetin thuộc phân nhóm II vì hoạt chất rất khó tan trong nước.
Điều này được thể hiện ở giá trị log D của quercetin tại các pH từ 1,2 đến 6,8 là khá cao từ 3,21 đến 3,80. Sau khi tạo phức với PL, theo bảng 3.31, hệ số phân bố log D của quercetin có sự thay đổi đáng kể. Quercetin dạng phytosome đạt được sự cân bằng dầu - nước tốt hơn so với quercetin dạng tự do tại các môi trường thử nghiệm.
Kết quả này cũng tương tự kết quả của một số nghiên cứu về phytosome của các hoạt chất khác như giá trị log D ở các pH khác nhau (từ 1,5 đến 7,5) của hoạt chất thân nước oxymatrin tăng khoảng 10 lần từ 0,2 lên 2,0 sau khi tạo phức với phospholipid [148]. Hay với dược chất thân dầu tamoxifen, phytosome tamoxifen có giá trị log D tại pH 1,2; 4,5; 6,8 và 7;4 giảm so với dược chất tinh khiết (ví dụ log D7,5 giảm từ