CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.7. Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo
2.2.7.1. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của phytosome quercetin
Tiến hành gây độc tính gan chuột bằng carbon tetraclorid [14], [80]. Yêu cầu đối với chuột nhắt thí nghiệm và chế độ nuôi dưỡng được thực hiện như trong mục 2.1.3. Quy trình tiến hành thí nghiệm được mô tả ở hình 2.3.
Nghiên cứu sử dụng đối chứng dương là silymarin của hãng Sigma - Aldrich với số hiệu S0292, lô số BCBM0730V, hàm lượng silybin A/B là 42,6 %.
Chuẩn bị hỗn dịch quercetin và hỗn dịch phytosome quercetin với thành phần như ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần hỗn dịch quercetin và hỗn dịch phytosome quercetin Hỗn dịch quercetin Hỗn dịch phytosome quercetin
Quercetin 0,26 g Phytosome quercetin 1,1 g
Nước tinh khiết vđ 20 ml Nước tinh khiết vđ 20 ml Đối với hỗn dịch chứa quercetin, tiến hành nghiền quercetin và thêm dần 2 ml nước tạo hỗn dịch đặc. Phân tán bột nhão vào 20 ml nước tinh khiết để tạo hỗn dịch quercetin. Đối với hỗn dịch chứa phytosome quercetin, tiến hành phân tán trực tiếp phytosome quercetin vào nước tinh khiết. Hỗn dịch được khuấy từ liên tục trong suốt thời gian cho chuột uống.
Bố trí thí nghiệm: 42 con chuột nhắt trắng thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, có độ tuổi từ 5 - 6 tuần tuổi, được chia ngẫu nhiên thành 7 lô, mỗi lô 6 con.
- Lô 1 (Đối chứng sinh lý): Chuột được chăm sóc bằng chế độ bình thường, uống nước cất 0,2 ml/con/ngày.
- Lô 2 (Đối chứng bệnh lý): Chuột được gây độc tính gan bằng cách tiêm màng bụng carbon tetraclorid một lần duy nhất và được chăm sóc với chế độ bình thường, uống nước cất 0,2 ml/con/ngày.
- Lô 3 (Đối chứng tham khảo): Chuột được chăm sóc với chế độ bình thường, uống silymarin liều 50 mg/kg thể trọng (kgP)/ngày.
- Lô 4 (Mẫu thử): Chuột được chăm sóc với chế độ bình thường, uống 0,2 ml hỗn dịch chứa quercetin liều 50 mg/kgP/ngày.
52
- Lô 5 (Mẫu thử): Chuột được chăm sóc với chế độ bình thường, uống 0,2 ml hỗn dịch chứa quercetin liều 100 mg/kgP/ngày.
- Lô 6 (Mẫu thử): Chuột được chăm sóc với chế độ bình thường, uống 0,2 ml hỗn dịch chứa phytosome quercetin liều 50 mg quercetin/kgP/ngày.
- Lô 7 (Mẫu thử): Chuột được chăm sóc với chế độ bình thường, uống 0,2 ml hỗn dịch chứa phytosome quercetin liều 100 mg quercetin/kgP/ngày.
Chuột ở tất cả các lô được uống mẫu (nước cất, mẫu đối chứng và mẫu thử), 1 lần/ngày vào buổi sáng, liên tục 7 ngày trước khi gây độc cho gan. Chuột được cho uống mẫu bằng bơm tiêm có kim đầu tù, mẫu được bơm thẳng vào dạ dày chuột. Ngày thứ 7, tiến hành gây độc tính gan bằng cách tiêm màng bụng CCl4 liều 0,2 ml/kg (tính theo thể tích CCl4 nguyên chất) cho tất cả các lô. CCl4 được pha trong dầu ô liu ở nồng độ 10 %. Ngoại trừ, lô đối chứng sinh lý được tiêm dầu ô liu.
Sau khi gây độc 48 giờ, lấy máu ở hốc mắt xác định hoạt độ ALT, AST bằng máy định lượng sinh hóa bán tự động của Beckman Coulter AU680. Sau đó, giết chuột, tách lấy gan, rửa sạch bằng nước muối sinh lý lạnh, cân khối lượng gan, chụp ảnh đại thể gan và một phần gan được sử dụng cho thí nghiệm xác định hàm lượng malondialdehyd và glutathion trong gan.
Nuôi thích nghi Uống hỗn dịch phytosome quercetin hoặc quercetin -7 ngày 0 7 ngày 9 ngày
Gây độc gan Lấy máu ở hốc mắt
bằng CCl4 giết chuột, tách lấy gan
đồng nhất để đánh giá chỉ số sinh hóa Hình 2.3. Quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
in vivo theo mô hình gây độc tính gan bằng carbon tetraclorid Thông số đánh giá:
- Xác định chức năng gan: thông qua định lượng amino transferase (AST, ALT) trong huyết thanh chuột. Tiến hành: lấy máu chuột, ly tâm 10.000 vòng trong 10 phút, thu huyết thanh, đọc kết quả trên hệ thống AU680 của hãng Beckman Coulter.
- Kiểm tra trực quan gan: Sau khi lấy máu xét nghiệm, chuột được giết bằng cách kéo giãn đốt sống cổ và mổ nhanh để đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử trên khối lượng gan.
53
- Xác định hàm lượng malondialdehyd trong gan: Gan chuột được nghiền trong dung dịch đệm KCl 1,15 % theo tỷ lệ 1:10 (gan : dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 - 5oC. Lấy 1 ml dịch đồng thể, thêm 0,5 ml đệm Tris - HCl, ủ ở 37oC trong 1 giờ.
Kết thúc phản ứng bằng 0,5 ml acid tricloacetic 10 %, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy 0,5 ml dịch trong cho phản ứng với 0,5 ml acid thiobarbituric 0,8
%, ủ ở 95 - 100oC trong 15 phút và đo màu ở λ = 532 nm. Hàm lượng MDA (nM/ml) được tính theo phương trình hồi quy chất chuẩn MDA: y = ax + b. Trong đó: y là giá trị độ hấp thụ quang, x là hàm lượng MDA.
- Xác định hàm lượng glutathion trong gan: Gan chuột được nghiền trong dung dịch đệm KCl 1,15 % theo tỷ lệ 1:10 (gan : dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 - 5oC.
Lấy 1 ml dịch đồng thể, thêm 0,5 ml đệm Tris - HCl, ủ ở 37oC trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng bằng 0,5 ml acid tricloacetic 10 %, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút.
Lấy 10 àl dịch trong cho phản ứng với hỗn hợp gồm 37,5 àl Tris - HCl pH 8,2; 12,5 àl DTNB 150 àM và 200 àl methanol. Hỗn hợp được để yờn trong 3 phỳt ở nhiệt độ phòng và đo màu ở λ = 405 nm. Hàm lượng GSH (nM/ml) được tính theo phương trình hồi quy chất chuẩn GSH: y = ax + b. Trong đó: y là giá trị độ hấp thụ quang, x là hàm lượng GSH.
2.2.7.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của viên nang chứa phytosome quercetin
Tiến hành gây độc tính gan chuột bằng carbon tetraclorid [14], [80]. Yêu cầu đối với chuột nhắt thí nghiệm, chế độ nuôi dưỡng và quy trình tiến hành thí nghiệm tương tự như đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của phytosome quercetin.
Chuẩn bị mẫu: Mở vỏ 20 viên nang, sau đó cân lượng cốm tương ứng với khối lượng một viên và phân tán toàn bộ cốm trong nước tinh khiết vừa đủ 10 ml hỗn dịch. Hỗn dịch được khuấy từ liên tục trong suốt thời gian cho chuột uống mẫu.
Chuột được cho uống mẫu bằng bơm tiêm có kim đầu tù với liều 50 mg quercetin/kg chuột/ngày (10 ml hỗn dịch/kg chuột/ngày), hỗn dịch được bơm thẳng vào dạ dày chuột. Thể tích hỗn dịch cho uống được hiệu chỉnh theo khối lượng từng chuột.
Bố trí thí nghiệm: 18 con chuột nhắt trắng thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, có độ tuổi từ 5 - 6 tuần tuổi, được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 6 con.
- Lô 1 (Đối chứng bệnh lý): Chuột được gây độc tính gan bằng cách tiêm màng bụng carbon tetraclorid một lần duy nhất và được chăm sóc với chế độ bình thường, uống nước cất 0,2 ml/con/ngày.
54
- Lô 2 (Mẫu viên nang quercetin): Chuột được chăm sóc với chế độ bình thường, uống lượng hỗn dịch chứa bột đóng nang tương ứng với quercetin liều 50 mg/kgP/ngày.
- Lô 3 (Mẫu viên nang phytosome quercetin): Chuột được chăm sóc với chế độ bình thường, uống lượng hỗn dịch chứa bột đóng nang tương ứng với phytosome quercetin liều 50 mg quercetin/kgP/ngày.
Chuột ở 3 lô được uống nước cất và mẫu thử, 1 lần/ngày vào buổi sáng, liên tục 7 ngày trước khi gây độc cho gan. Ngày thứ 7, tiến hành gây độc tính gan bằng cách tiêm màng bụng CCl4 liều 0,2 ml/kg (tính theo thể tích CCl4 nguyên chất) cho tất cả các lô. CCl4 được pha trong dầu ô liu ở nồng độ 10 %.
Sau khi gây độc 48 giờ, lấy máu ở hốc mắt xác định hoạt độ ALT, AST bằng máy định lượng sinh hóa bán tự động của Beckman Coulter AU680. Sau đó, giết chuột, tách lấy gan, rửa sạch bằng nước muối sinh lý lạnh và tiến hành xác định hàm lượng malondialdehyd trong gan.