CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xây dựng/thẩm định một số phương pháp đánh giá
3.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Độ đặc hiệu
Chuẩn bị các mẫu sau (theo mục 2.2.3.1.a): Mẫu chuẩn là dung dịch quercetin chuẩn cú nồng độ quercetin 20 àg/ml; mẫu thử là dung dịch phytosome quercetin (tỷ lệ quercetin : HSPC là 1:1) có nồng độ quercetin tương đương với mẫu chuẩn và mẫu trắng.
Tiêm mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng qua cột sắc ký với các điều kiện sắc ký được trình bày ở mục 2.2.3.1.a và đánh giá pic sắc ký xuất hiện trên sắc ký đồ.
Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn xuất hiện một pic cân xứng với hệ số bất đối 1,174 có thời gian lưu (tR) là 7,307 phút (hình PL 1.2). Trên sắc ký đồ của mẫu thử cho một pic có thời gian lưu 7,293 phút tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn (hình PL 1.3). Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic lạ tại vị trí pic của quercetin (hình PL 1.1). Điều đó chứng tỏ phương pháp có độ đặc hiệu cao và hoạt chất quercetin có thời gian lưu 7,3 phút với điều kiện sắc ký đã lựa chọn.
Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần trên một dung dịch chuẩn có nồng độ quercetin 20 àg/ml với cỏc điều kiện chạy sắc ký được thể hiện ở mục 2.2.3.1.a, ghi lại cỏc giá trị về thời gian lưu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký Lần đo Thời gian lưu tR
(phút)
Diện tích pic
(mAU.s) Hệ số bất đối xứng
1 7,323 1573557 1,170
2 7,344 1579209 1,171
3 7,352 1578579 1,173
4 7,317 1578790 1,177
5 7,261 1565963 1,174
6 7,250 1572861 1,176
TB 7,308 1574827
RSD (%) 0,6 0,3
Yêu cầu ≤ 2,0 % ≤ 2,0 %
56
Các số liệu thu được cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic nhỏ hơn 2,0 %. Các giá trị hệ số bất đối xứng nằm trong khoảng 0,8 đến 1,5. Số đĩa lý thuyết trung bình là 6446. Như vậy, chương trình sắc ký đã lựa chọn phù hợp để định lượng quercetin trong các mẫu nghiên cứu.
Tính tuyến tính
Tiến hành khảo sát khoảng nồng độ từ 5 g/ml đến 35 g/ml với 7 mẫu chuẩn quercetin pha trong methanol và định lượng bằng phương pháp HPLC theo chương trình đã lựa chọn. Kết quả được trình bày ở bảng PL 1.1 và hình 3.1.
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic với nồng độ của dung dịch quercetin trong methanol
Từ kết quả phân tích thu được phương trình biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ quercetin có dạng y = 80536x - 11553. Tiến hành phân tích thống kê, thu được kết quả:
pF = 0,00 < 0,05: Phương trình hồi quy có tính thích hợp.
pb = 0,55 > 0,05 (tb = - 0,635 < t0,05 = 2,776 ): hệ số b không có ý nghĩa.
pa = 0,00 < 0,05 (ta = 98,917 > t0,05 = 2,776 ): hệ số a có ý nghĩa.
Do đó, phương trình hồi quy có dạng: y = 80536x. Vì vậy, kết quả cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch chuẩn trong khoảng nồng độ đã khảo sát với hệ số tương quan R2 = 0,9995.
Độ chính xác được đánh giá dựa trên độ lặp lại của 6 thí nghiệm riêng biệt.
Pha 6 mẫu dung dịch thử chứa phytosome quercetin (tỷ lệ quercetin : HSPC là 1:1) cú nồng độ quercetin 20 àg/ml. Kết quả đỏnh giỏ độ chớnh xỏc theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.3.1.a được trình bày ở bảng 3.2.
y = 80536x - 11553 R² = 0.9995
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Diện tích pic (mAU.s)
Nồng độ (àg/ml)
57
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp STT Thời gian lưu
tR (phút)
Diện tích pic (mAU.s)
Nồng độ mẫu thử (àg/ml)
Phần trăm hàm lƣợng (%)
1 7,314 1599586 20,01 100,1
2 7,321 1594948 19,95 99,8
3 7,367 1596028 19,96 99,8
4 7,361 1621135 20,27 101,4
5 7,317 1597128 19,97 99,9
6 7,265 1605430 20,08 100,4
TB (%) 100,2
RSD (%) 0,7
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy mẫu thử có phần trăm hàm lượng hoạt chất nằm trong khoảng từ 99,8 % đến 101,4 % với độ lệch chuẩn RSD nhỏ hơn 2,0 %. Do đó, phương pháp có độ chính xác đạt yêu cầu cho việc phân tích hoạt chất trong mẫu.
Độ đúng
Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp HPLC định lượng quercetin được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ đúng của hệ thống sắc ký
% thêm vào
Lƣợng thêm vào (mg)
Diện tích pic (mAU.s)
Lƣợng tìm lại (mg)
Độ thu hồi (%)
TB (%)
RSD (%)
10 1
1762545 0,994 99,4
100,4 1,3
1763209 0,998 99,8
1766479 1,019 101,9
20 2
1919843 1,971 98,6
99,8 1,1
1924910 2,002 100,1
1926995 2,015 100,8
30 3
2089462 3,024 100,8
100,1 0,9
2087703 3,013 100,4
2081188 2,973 99,1
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy các mẫu đều có phần trăm tìm lại nằm trong khoảng từ 98,0 % đến 102,0 %, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao, đảm bảo phép phân tích tốt khi xác định hàm lượng quercetin trong chế phẩm.
Kết luận: Qua kết quả đánh giá các tiêu chí trên, phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký đã lựa chọn đạt yêu cầu về thẩm định và có thể sử dụng trong phân tích hàm lượng quercetin.
58