Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của phytosome

1.2. Tổng quan về phytosome

1.2.6. Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của phytosome

Tính chất và đặc điểm của phytosome gắn rất chặt với sự phân bố và tác dụng của tiểu phân trong cơ thể. Vì vậy, kiểm soát, đánh giá được tính chất của tiểu phân phytosome trong quá trình bào chế và sử dụng là hết sức quan trọng. Hiện nay, có nhiều phương tiện ghi hình và phân tích hiện đại có độ nhạy và độ chính xác cao, cho phép các nhà khoa học ngày càng tiệm cận gần hơn với hình thái và bản chất của tiểu phân phytosome.

20

- Hình thái tiểu phân được quan sát bằng các loại kính hiển vi điện tử và quang phổ hiện đại như:

+ Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (transmission electron microscopy) cho hình ảnh về hình thái, cấu trúc tinh thể, số lượng và hướng của tiểu phân với độ phân giải cao. Các đặc tính bề mặt này thu được khi một chùm tia điện tử truyền qua một mẫu siêu mỏng, tương tác với mẫu khi nó đi qua [40]. Nhược điểm của phương pháp này là quy trình chuẩn bị mẫu đo TEM phức tạp và tốn khá nhiều thời gian.

+ Kính hiển vi điện tử quét SEM (scanning electron microscopy) cung cấp hình ảnh bề mặt tiểu phân với độ phân giải từ 10 - 300.000 lần và đánh giá sơ bộ kích thước tiểu phân. Độ phân giải của SEM được xác định từ kích thước chùm điện tử hội tụ, mà kích thước này bị hạn chế bởi quang sai, chính vì thế mà SEM không thể đạt được độ phân giải tốt như TEM. Mặc dù vậy, nhưng SEM có điểm mạnh là phân tích mà không cần phá hủy mẫu vật, các thao tác điều khiển đơn giản hơn và giá thành của SEM thấp hơn rất nhiều so với TEM, vì thế đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong đánh giá hình ảnh bề mặt tiểu phân [40].

Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu vể hình thái bề mặt cho thấy thường các tiểu phân phytosome có hình cầu [123].

Hình 1.8. Hình ảnh SEM của phytosome (tỷ lệ quercetin:PC:cholesterol 1:2:0,2) [138]

- Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân có thể đo trực tiếp bằng SEM, TEM, hoặc được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động DLS (dynamic light scattering). DLS là một trong những phương pháp nhanh nhất và phổ biến nhất để xác định kích thước của các tiểu phân chuyển động Brown trong hỗn dịch keo với kích thước trong khoảng nano và dưới micromet [27].

+ Kích thước phytosome thay đổi trong phạm vi khá rộng, từ hàng chục đến hàng nghìn nanomet, nên các mẫu phytosome nói chung có chứa một phân bố các

21

kích thước khác nhau, mẫu càng đồng nhất có độ ổn định càng cao. Số liệu về sự sai khác kích thước được gọi là chỉ số đa phân tán PDI (polydispersity index). PDI là số liệu không có đơn vị, tương ứng với sai số tương đối của sự phân bố kích thước.

Yêu cầu hệ có phân bố kích thước càng hẹp càng tốt. Trên thực tế, đây là một tiêu chí rất khó đạt được, nhất là sự đồng nhất về phân bố kích thước giữa các lô mẻ.

+ Đánh giá kết quả: KTTP, PDI. Trong đó, KTTP (đơn vị đo “d.nm”: số nanomet đường kính tiểu phân) gần tương đương với KTTP trung bình của mẫu khi giá trị PDI nhỏ và dùng để so sánh về kích thước giữa các mẫu phytosome khác nhau. Khi PDI lớn (> 0,5) thì kích thước đo được không có ý nghĩa, dựa vào vị trí của các pic trên đồ thị phân bố KTTP để so sánh kích thước giữa các mẫu [139].

- Thế Zeta: Thiết bị đo kích thước dựa trên nguyên lý tán xạ ánh sáng động còn cho phép xác định thế Zeta. Bản chất của phytosome là hệ phân tán, kích thước phytosome ứng dụng trong dược phẩm thường dưới 1 àm, vỡ vậy thế Zeta phản ỏnh độ ổn định của hệ và ảnh hưởng tới phân bố sinh học của phytosome. Trong thực nghiệm, tiểu phân phân tán có giá trị tuyệt đối của thế Zeta ở giữa 30 và 60 mV sẽ tạo sự ổn định tĩnh điện học nhờ lực đẩy giữa các tiểu phân tích điện cùng dấu. Nếu giá trị này từ 5 đến 15 mV sẽ giới hạn độ bền vững của hệ phân tán hoặc từ 3 đến 5 mV thường xuất hiện hiện tượng không bền [27].

- Hệ số phân bố dầu - nước log P (partition coefficient) của một chất là giá trị logarit của tỷ số nồng độ chất đó dạng không ion hóa trong dung môi n-octanol và nước ở trạng thái cân bằng. log P trong khoảng 1 - 3 cho thấy khả năng hấp thu tốt hơn. Đây là một thông số quan trọng trong việc dự đoán tính thấm qua màng sinh học của hoạt chất. Kết quả tính toán được sẽ góp phần chứng minh khả năng cải thiện tính thấm của hoạt chất khi được bào chế dưới dạng tạo phức với phospholipid, qua đó thể hiện ý nghĩa của việc bào chế phytosome [93].

- Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa: Phần trăm hoạt chất phytosome hóa là tỷ lệ hoạt chất liên kết với PL so với lượng hoạt chất đem dùng trước khi bào chế [58], [64]:

EE (%) = hoạt chất trong phytosome/hoạt chất toàn phần x 100

Tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa thường yêu cầu khá cao và cần được giữ vững, không bị rò rỉ trong quá trình bảo quản. Hiệu suất này thay đổi rất nhiều theo bản chất của hoạt chất, phospholipid và dung môi. Việc xác định những thông số này đôi khi có thể gặp khó khăn liên quan đến độ chính xác của việc phân tách hoạt chất dạng tự do và hoạt chất trong phytosome.

22

Đa phần các nghiên cứu sử dụng phương pháp siêu ly tâm, tuy nhiên, tính hiệu suất tạo phytosome theo phương pháp này có thể mắc một số sai số và phụ thuộc khá nhiều vào KTTP của hoạt chất và phytosome. Hiện nay, một số tác giả đánh giá hiệu suất thông qua việc sử dụng dung môi có khả năng hòa tan chọn lọc phytosome hoặc dạng tự do, ví dụ, cloroform là dung môi hòa tan chọn lọc phytosome cao bạch quả [33].

- Nhằm đánh giá tương tác phân tử giữa hoạt chất - phospholipid cũng như xác định cấu trúc của phytosome, tiến hành quét một số phổ sau:

 Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy)

FTIR hiện nay được dùng khá phổ biến vì cho phép đo độ hấp thụ đặc trưng của các dao động phân tử trong mẫu. Theo lý thuyết, trong phytosome, đầu phân cực của PL (nhóm phosphat và/hoặc nhóm amonium) liên kết với nhóm -OH của hoạt chất tạo sự tương tác liên phân tử, và chính sự tương tác này làm dịch chuyển bước sóng hấp thụ của các nhóm chức. Do đó, có thể sử dụng phổ hồng ngoại để đánh giá tương tác giữa hoạt chất và PL trong phytosome. Đồng thời, đây cũng là một công cụ đáng tin cậy để đánh giá độ ổn định của phytosome [37], [138].

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (nuclear magnetic resonance )

Phương pháp quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ứng dụng để xác định các thành phần của công thức và phân tích tương tác giữa hoạt chất - PL [103].

Trong hầu hết các nghiên cứu, khi so sánh phổ 1H - NMR của phytosome với PL nhận thấy tín hiệu của chuỗi acid béo hầu như không thay đổi. Điều này chứng minh hai chuỗi acid béo của PL không tham gia vào liên kết hóa học. Trong khi đó, tín hiệu của những nguyên tử liên quan đến sự hình thành phytosome có sự thay đổi (tín hiệu proton của hoạt chất, PL được mở rộng và đặc biệt có sự chuyển dịch về phía trường cao của nhóm N-(CH3)3) [65]. Ngoài ra, có thể sử dụng phổ P35 - NMR chất rắn để xác định trạng thái tập hợp của PL trong phytosome.

 Phổ khối MS

Phổ khối MS là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành từ pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử hoặc bằng dalton. Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số pic có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ. Phổ đồ sẽ cung cấp

23

thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) cũng như xác định cấu trúc và định lượng hoạt chất [51]. Như vậy, thông qua phổ MS xác định được khối lượng phân tử của hoạt chất, phospholipid và phytosome tương ứng, các thông tin đó sẽ hỗ trợ trong việc chứng minh sự hình thành phytosome cũng như xác định tỷ lệ phản ứng giữa hoạt chất : PL.

 Kỹ thuật phân tích nhiệt quét vi sai DSC (differential scanning calorimetry) DSC dựa trên sự thay đổi nhiệt độ và nhiệt lượng tỏa ra từ mẫu khi bị đốt nóng và so sánh với thông tin từ mẫu chuẩn [52]. Kết quả từ phân tích DSC có ý nghĩa trong việc xác định mức độ tinh thể của hoạt chất, cũng như trạng thái tồn tại của phytosome, qua đó đánh giá sự thay đổi của hoạt chất khi liên kết với PL so với hoạt chất tinh khiết. Phương pháp DSC có nhiều ưu điểm như đánh giá nhanh các biến đổi có khả năng xảy ra bằng cách phát hiện các thay đổi về tính chất, có sự chuyển dịch hoặc biến mất của các các quá trình nóng chảy. Ví dụ trên phổ DSC của phytosome quercetin, các pic thu nhiệt đặc trưng của quercetin, PL đã biến mất hoàn toàn, thay vào đó là sự xuất hiện pic thu nhiệt mới [100]. Sự giảm mức độ tinh thể của hoạt chất trong phytosome so với hoạt chất dạng tự do cũng được chứng minh trong một nghiên cứu của Song Y. và cộng sự (2008) [120] với pic thu nhiệt của phytosome, silybin và PC lần lượt là 68,8oC; 136,5oC và 229,6oC. Trong hỗn hợp vật lý PC-silybin có hai đỉnh thu nhiệt là 68,8oC và 136,5oC. Đỉnh 68,8oC xuất hiện có thể là do phytosome đã được hình thành trong quá trình đun nóng.

Hình 1.9. Đồ thị phân tích nhiệt vi sai của quercetin (A), phosphatidyl cholin (B), cholesterol (C)

và phytosome quercetin tỷ lệ quercetin:PC: cholesterol là 1:2:0,2 (D) [100]

24

 Phổ nhiễu xạ tia X trạng thái rắn (XRD, X - ray powder diffraction)

Phương pháp nhiễu xạ tia X là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để xác định cấu trúc của một tinh thể chưa biết bằng cách sử dụng một chùm tia X song song, hẹp, đơn sắc chiếu vào mẫu. Sự xuất hiện hay biến mất các đỉnh nhiễu xạ sẽ thể hiện trạng thái kết tinh hay vô định hình của mẫu. Với một chất ở dạng tinh thể, giản đồ tia X có nhiều pic hẹp, trong khi đó sự xuất hiện pic nhiễu xạ rộng trên giản đồ thể hiện chất đó tồn dạng vô định hình [36]. Sự thay đổi từ trạng thái kết tinh của hoạt chất sang dạng vô định hình sau khi tạo liên kết với PL đã được chứng minh trong một số nghiên cứu khác nhau (hình 1.10). Đây là cơ sở để chứng minh khả năng cải thiện độ tan của phytosome, qua đó tăng khả năng hấp thu và sinh khả dụng của hoạt chất khi so sánh với nguyên liệu.

Hình 1.10. Giản đồ nhiễu xạ tia X của naringenin, phosphatidyl cholin, và phytosome naringenin tỷ lệ 1:1 [108]

 Tóm lại, để chứng minh được sự hình thành phytosome, cần phối hợp nhiều phương pháp vật lý khác nhau, không dựa trên duy nhất một phương pháp nào cả.