CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xây dựng/thẩm định một số phương pháp đánh giá
3.1.2. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-Vis
Độ đặc hiệu
Chuẩn bị các mẫu sau: Mẫu chuẩn là dung dịch quercetin chuẩn có nồng độ quercetin 5 àg/ml; mẫu thử là dung dịch phytosome quercetin (tỷ lệ quercetin : HSPC là 1:1) cú nồng độ quercetin toàn phần 5 àg/ml và mẫu trắng (theo mục 2.2.3.1.b).
Tiến hành quét phổ UV-Vis của các dung dịch trên trong khoảng bước sóng từ 200 đến 600 nm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 và hình PL 1.6.
Bảng 3.4. Phổ UV-Vis của quercetin và phytosome quercetin Cực đại hấp
thụ (nm) A Cực tiểu hấp
thụ (nm) A
Quercetin (5 àg/ml) 370,0 0,420 285,5 0,119
255,5 0,391 237,0 0,240
Phytosome quercetin (quercetin toàn phần 5 àg/ml)
370,5 0,428 285,5 0,129
256,0 0,406 237,0 0,260
- Theo kết quả nghiên cứu, HSPC hấp thụ yếu các tia sáng có bước sóng < 300 nm, và không hấp thụ tia sáng có bước sóng > 300 nm (hình PL 1.6).
- So sánh phổ UV-Vis của phytosome quercetin với phổ UV-Vis của quercetin nhận thấy phytosome quercetin và quercetin có hình dạng phổ giống nhau (hình PL 1.6). Theo bảng 3.4, vị trí các pic hấp thụ và giá trị hấp thụ tại cực đại của quercetin và phytosome là tương tự nhau.
- Từ những phân tích trên có thể thấy HSPC không hấp thụ tia sáng có bước sóng > 300 nm do bản thân phân tử HSPC không có liên kết bội trong phân tử (được hydro hóa khi sản xuất). Vì vậy, khi hình thành phytosome, HSPC không làm thay đổi tính chất hấp thụ quang học của quercetin. Do đó, có thể định lượng quercetin trong phytosome bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis mà không cần chất chuẩn phytosome quercetin hoặc phải phân hủy phytosome giải phóng quercetin tự do.
Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành đo độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn cú nồng độ 5 àg/ml lặp lại 6 lần. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của độ hấp thụ quang. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống
Lần đo 1 2 3 4 5 6
Độ hấp thụ quang (D) 0,448 0,449 0,447 0,452 0,450 0,451
59
Các số liệu thu được cho thấy giá trị RSD của độ hấp thụ quang là 0,4 % nhỏ hơn 2,0 %. Như vậy, phương pháp xây dựng phù hợp để định lượng quercetin trong các mẫu nghiên cứu.
Tính tuyến tính
Tiến hành pha các dung dịch quercetin chuẩn trong ethanol tuyệt đối có nồng độ từ 2 g/ml đến 8 g/ml. Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch này ở bước sóng 370 nm. Kết quả thể hiện ở bảng PL 1.2 và hình 3.2.
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ quang (D) với nồng độ (C) của dung dịch quercetin trong ethanol tuyệt đối
Từ kết quả phân tích thu được phương trình biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ quang và nồng độ quercetin có dạng y = 0,0916x - 0,0036. Tiến hành phân tích thống kê, thu được kết quả:
pF = 0,00 < 0,05: Phương trình hồi quy có tính thích hợp.
pb = 0,46 > 0,05 (tb = - 0,800 < t0,05 = 2,776 ): hệ số b không có ý nghĩa.
pa = 0,00 < 0,05 (ta = 110,419 > t0,05 = 2,776 ): hệ số a có ý nghĩa.
Do đó, phương trình hồi quy có dạng: y = 0,0916x. Vì vậy, kết quả cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ quang và nồng độ dung dịch chuẩn trong khoảng nồng độ đã khảo sát với hệ số tương quan R2 = 0,9996.
Độ chính xác được đánh giá dựa trên độ lặp lại của 6 thí nghiệm riêng biệt.
Pha 6 mẫu dung dịch thử chứa phytosome quercetin (tỷ lệ quercetin : HSPC là 1:1) cú nồng độ quercetin 5 àg/ml. Kết quả đỏnh giỏ độ chớnh xỏc theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.3.1.b được trình bày ở bảng 3.6.
y = 0.0916x - 0.0036 R² = 0.9996
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Độ hấp thụ quang (D)
Nồng độ (àg/ml)
60
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp STT Độ hấp thụ quang Nồng độ mẫu thử
(àg/ml)
Phần trăm hàm lƣợng (%)
1 0,460 5,06 101,2
2 0,453 4,98 99,6
3 0,457 5,03 100,6
4 0,450 4,95 99,0
5 0,452 4,97 99,4
6 0,449 4,94 98,8
TB (%) 99,8
RSD (%) 0,9
Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy mẫu thử có phần trăm hàm lượng hoạt chất nằm trong khoảng từ 98,8 % đến 101,2 % với độ lệch chuẩn RSD nhỏ hơn 2,0 %. Do đó, phương pháp có độ chính xác đạt yêu cầu cho việc phân tích hoạt chất trong mẫu.
Độ đúng
Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp UV-Vis định lượng quercetin được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp UV-Vis định lượng quercetin
% thêm vào
Lƣợng thêm vào (mg)
Độ hấp thụ quang
Lƣợng tìm lại (mg)
Độ thu hồi (%)
TB (%)
RSD (%)
10 2
0,503 2,014 100,7
99,7 0,9
0,497 1,990 99,5
0,494 1,978 98,9
20 4
0,544 3,992 99,8
100,1 0,3
0,545 3,999 100,0
0,547 4,014 100,4
30 6
0,588 5,971 99,5
100,0 0,5
0,593 6,021 100,4
0,591 6,001 100,0
Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy các mẫu đều có phần trăm tìm lại nằm trong khoảng từ 98,0 % đến 102,0 %, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao, đảm bảo phép phân tích tốt khi xác định hàm lượng quercetin trong chế phẩm.
Kết luận: Qua đánh giá các tiêu chí trên, phương pháp UV-Vis đạt yêu cầu về thẩm định và có thể sử dụng trong phân tích hàm lượng quercetin.
61
Tiến hành bào chế hai mẫu viên theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.2:
Mẫu chứa phytosome quercetin và mẫu không chứa phytosome quercetin - mẫu placebo (loại và tỷ lệ các tá dược tương ứng như trong công thức viên nang chứa phytosome quercetin).
Kết quả đo độ hấp thụ quang của các mẫu được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.8. Độ hấp thụ quang của mẫu chứa phytosome quercetin và mẫu placebo
STT 1 2 3 4 5 6 Trung bình
Dphytosome 0,431 0,437 0,435 0,440 0,432 0,438 0,436 ± 0,004
D0 0,004 0,004 0,003 0,004 0,003 0,003 0,0035±0,0005 (D0/Dphytosome)×100(%) 0,928 0,915 0,690 0,909 0,694 0,684 0,803 ± 0,125
Từ kết quả trên có thể thấy tỷ lệ
< 1 % chứng tỏ các tá dược trong công thức không có ảnh hưởng đến sự hấp thụ quang học của quercetin trong môi trường ethanol ở bước sóng 370 nm.