Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc và đặc điểm ung thư
1.3.1. Một số kháng thể đang được sử dụng trong nghiên cứu và thực tiễn hiện nay
1.3.1.5. Kháng thể phage-scFv
Kháng thể phage-scFv là một thực khuẩn thể hình sợi mang các mảnh kháng thể ở một đầu của nó, hiện nay thực khuẩn thể được dùng nhiều nhất để biểu lộ kháng thể là M13. Kháng thể phage-scFv được tạo ra nhờ công nghệ phage display.
- Cấu trúc của kháng thể phage-scFv Cấu trúc của thực khuẩn thể M13
Hệ gen của phage có hình sợi, nhỏ, chứa khoảng hơn 10 gen phân bố sát nhau và một vùng không mã hóa, chứa trình tự cần thiết cho sự nhân bản và
đóng gói của phage. Khác với các virus gây nhiễm vi khuẩn khác, phage hình sợi được tổng hợp và bài tiết khỏi tế bào vi khuẩn chủ mà không làm tan tế bào chủ. Các phage f1, M13, fd đã được sử dụng để biểu hiện các chuỗi polypeptide. Hệ gen của các phage hình sợi có sự tương đồng với nhau hơn 98% và các sản phẩm gen của chúng có thể thay thế cho nhau, vì vậy mà các phage này được gọi chung là phage Fd. M13 kiểu dại có đường kính khoảng 65A0, dài 9300A0. Trong cấu trúc virion của M13 chứa bộ gen DNA mạch đơn có độ lớn 6407 bp [55] bao gói trong 2700 bản sao protein vỏ chính, pVIII.
Mỗi đầu của phage được bao phủ bởi hai protein vỏ phụ: một đầu gồm 5 bản sao của pVII và pIX, đầu kia chứa 5 bản sao của pIII và PVI. Ngoài các protein vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII, pX, pV, pI, pIV, pXI. Chiều dài của virion phụ thuộc vào chiều dài của bộ gen: bộ gen dài hơn sẽ tạo ra phage dài hơn và ngược lại. Điều đặc biệt là bộ gen có thể gắn thêm đoạn DNA lớn, kích thước bộ gen có thể lên đến gần 12.000 bp mà vẫn không phá vỡ quá trình bao gói của thể hoang dại [104].
Cấu trúc của kháng thể phage-scFv
Các gen mã hoá cho các mảnh kháng thể liên kết scFv có thể được dung hợp với hệ gen của M13 hoặc với gen mã hóa pIII kiểu dại. Tuy nhiên, việc gắn các gen kháng thể vào hệ gen của phage gặp một số bất lợi như:
Thứ nhất là hệ quả biến nạp của hệ gen phage thấp hơn nhiều so với phagemid, do đó làm cản trở việc xây dựng các thư viện kháng thể phức tạp.
Thứ hai, việc nhân bản và biểu hiện kháng thể gắn với việc nhân bản và biểu hiện của hệ gen, điều này dẫn tới việc chọn lọc rất khó khăn. Khi sử dụng hệ gen phage để chèn đoạn gen kháng thể thì tất cả các bản sao của pIII đều dung hợp với các mảnh kháng thể. Điều này là một lợi thế cho việc chọn lọc kháng thể có khả năng liên kết với kháng nguyên. Tuy nhiên, tốc độ nhiễm có thể bị giảm bởi pIII cần thiết cho việc xâm nhiễm vào E. coli thông qua lông
giới tính F. Kết quả, các phagemid được sử dụng rộng rãi trong việc bộc lộ các kháng thể phage. Kháng thể phage-scFv về cơ bản là giống với M13 kiểu dại, nhưng chúng có một số đặc điểm khác biệt sau:
Về cấu trúc protein, kháng thể phage-scFv mang đầy đủ các protein cấu trúc giống như M13, riêng protein pIII được dung hợp với phân tử kháng thể (Hình 1.6), như vậy một đầu của kháng thể phage-scFv sẽ đảm nhiệm chức năng liên kết với kháng nguyên.
Hình 1.6. Cấu trúc của phage mang gen mã hóa scFv [4]
Về hệ gen, kháng thể phage-scFv chỉ mang trong mình một phagemid chứa gen gIII dung hợp với gen mã hóa cho kháng thể.
Đối với thư viện Griffin.1, các scFv được đưa vào phagemid pHEN2, phagemid này chứa tín hiệu nhân bản, promoter, gen kháng kháng sinh và tín hiệu tạo hình thái phage riêng [45]. Điều này cho phép phagemid có thể bọc gói lắp ráp thành hạt phage. Bằng cách sử dụng các phagemid, việc nhân bản và tạo ra kháng thể độc lập với hệ gen phage có thể thực hiện được. Tuy nhiên, để tạo
ra các kháng thể phage-scFv hoàn chỉnh phải cần tới sự có mặt của helper phage, thường dùng là M13K07.
- Ưu điểm của kháng thể phage-scFv
Các kháng thể phage-scFv có một số ưu điểm so với các kháng thể tạo ra bằng kỹ thuật lai tế bào (hybridoma), cụ thể là tạo kháng thể bằng kỹ thuật lai dung hợp cần thời gian và các thiết bị chuyên dụng; trong khi đó, kỹ thuật bộc lộ trên thực khuẩn thể (phage display) thì các gen kháng thể được tách dòng trực tiếp từ các tế bào lá lách với các kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Việc tạo ra thư viện kháng thể phage-scFv từ các nguồn gen có thể loại bỏ việc gây miễn dịch động vật thí nghiệm và nuôi cấy một lượng lớn các tế bào dung hợp và cho phép tách kháng thể có ái lực cao kháng lại bất kỳ kháng nguyên nào.
Biểu hiện trên phage có hiệu ích lớn trong trường hợp mà các kháng thể đơn dòng không thể thu nhận được bằng kỹ thuật lai dung hợp, chẳng hạn các kháng thể kháng lại các kháng nguyên là các độc tố và các chất không gây đáp ứng miễn dịch. Kỹ thuật kháng thể phage-scFv cũng có thể sử dụng để tách dòng và thu nhận các kháng thể đơn dòng từ các thể lai không ổn định về mặt di truyền. Các gen kháng thể phage-scFv còn là nguyên liệu để thu các kháng thể tái tổ hợp, từ đó kháng thể tái tổ hợp có thể được sản xuất nhanh chóng và kinh tế, đồng thời cũng có thể sử dụng trong y học để chẩn đoán và điều trị bệnh.
Kháng thể phage-scFv sử dụng lông giới tính F (pilus) để nhiễm vào E.
coli nhờ tương tác giữa pIII với lông giới tính. Hệ gen của kháng thể phage- scFv sau đó được chuyển vào tế bào chất của tế bào vi khuẩn, tại đó chúng nhân lên, dưới sự hỗ trợ của helperphage, các protein cần thiết cho quá trình đóng gói được tổng hợp, sắp xếp lại hình thành các kháng thể phage-scFv mới, sau đó giải phóng ra ngoài môi trường.
1.3.2. Các nghiên cứu về kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1