- Ghi phổ LCESIMS/MS
3.4.4.Kết quả chọn dòng kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-
CYFRA21-1
Để thu được kháng thể từ thư viện gắn đặc hiệu với kháng nguyên CYFRA21-1, như đã trình bày ở trên, chúng tôi tiến hành sàng lọc 4 vòng để xác định ái lực riêng của từng dòng với kháng nguyên CYFRA21-1. Một trong các phương pháp đơn giản và thường được áp dụng nhất trong kỹ thuật phage display để xác định ái lực của phage bộc lộ kháng thể với kháng nguyên đích là ELISA.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành cố định kháng nguyên CYFRA21-1 trên khay ELISA 96 giếng, ủ mỗi giếng với dung dịch phage riêng biệt thu được ở trên. Các dòng phage sẽ gắn với kháng nguyên thông qua đoạn kháng thể biểu lộ trên nó. Theo lý thuyết, dòng phage có ái lực cao với kháng nguyên CYFRA21-1 thì khả năng gắn càng tốt. Sau các bước rửa để loại bỏ các dòng phage không gắn đặc hiệu hoặc không gắn với kháng nguyên đích, bổ sung kháng thể kháng M13 cộng hợp với enzym peroxidase
(anti-M13 horseradish peroxidase-conjugate) vào mỗi giếng. Khi có H2O2, horseradish peroxidase sẽ oxy hóa TMB tạo ra cơ chất có màu xanh, hấp thụ bước sóng 630 nm – 650 nm. Phản ứng này diễn ra như sau:
HRP + H2O2 [HRP.H2O2]
[HRP.H2O2] + (TMB)H2 HRP + 2H2O2 + TMB
Phản ứng hóa học này sẽ được dừng lại bởi tác dụng của H2SO4, lúc này sản phẩm cuối cùng của quá trình ELISA sẽ hấp thụ bước sóng 450 nm.
Sau 4 vòng sàng lọc, hỗn hợp phage thu được chứa chủ yếu các dòng phage mà kháng thể biểu hiện trên đó gắn đặc hiệu với kháng nguyên CYFRA21-1. Tuy nhiên, các dòng phage này có ái lực khác nhau với kháng nguyên CYFRA21-1. Vì vậy, để chọn ra kháng thể scFv gắn đặc hiệu và có ái lực cao với kháng nguyên CYFRA21-1, chúng tôi chọn ngẫu nhiên 24 dòng phage khác nhau và xác định ái lực gắn với CYFRA21-1 bằng phương pháp ELISA.
Sử dụng 100 µl dịch kháng nguyên (trong trường hợp này là epitopee kháng nguyên CYFRA21-1) tái tổ hợp (100 ng) cho vào mỗi giếng của khay thử 96 giếng, phủ khay qua đêm ở nhiệt độ phòng. Rửa khay 5 lần với PBS, làm khô trên giấy thấm. Bổ sung vào mỗi giếng 300 µl MPBS, ủ 2 giờ ở 37oC, rửa 5 lần với PBS, làm khô.
Thêm 100 µl kháng thể phage vào mỗi giếng, ủ 90 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa 5 lần với T-PBS (PBS, Tween 20), 5 lần với PBS. Bổ sung 100 µl kháng thể cộng hợp anti-M13, để 90 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa 5 lần với T- PBS, 5 lần với PBS. Bổ sung vào mỗi giếng 100 µl TMB, để 10 phút ở nhiệt độ phòng. Bổ sung 50 µl H2SO4 nồng độ 1 N. Xác định độ hấp thụ tại bước sóng 450 nm để chọn các phage mang kháng thể đặc hiệu mong muốn. Kết quả sàng lọc một số dòng tế bào biểu hiện kháng thể phage được trình bày trên bảng 3.4 và hình 3.20.
Các dòng biểu hiện kháng thể OD (450-650) Các dòng biểu hiện kháng thể OD (450-650) Clone1 0.073 Clone13 0.078 Clone2 0.065 Clone14 0.147 Clone3 0.142 Clone15 0.066 Clone4 0.061 Clone16 0.063 Clone5 0.068 Clone17 0.055 Clone6 0.070 Clone18 0.079 Clone7 0.096 Clone19 0.085 Clone8 0.073 Clone20 0.073 Clone9 0.075 Clone21 0.063 Clone10 0.211 Clone22 0.127 Clone11 0.053 Clone23 0.058 Clone12 0.089 Clone24 0.083
Hình 3.20. Kết quả chọn các dòng mang kháng thể đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1 bằng kỹ thuật ELISA Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc, lựa chọn các dòng biểu lộ kháng thể
Kết quả ở Bảng 3.5 và Hình 3.20 cho thấy dòng phage mang kháng thể số 10 (clone 10) có ái lực cao nhất trong số các dòng đã sàng lọc. Vì vậy, dòng số 10 được chọn lựa cho việc xác định trình tự cũng như các thí nghiệm tiếp theo.