- Ghi phổ LCESIMS/MS
3.6.Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp
viện Bạch Mai cung cấp
Sau khi đã thử nghiệm thành công định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trên các mẫu HT được cung cấp bởi bệnh viện Trung ương Quân đội 108, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên các mẫu bệnh phẩm (mẫu huyết thanh, kháng nguyên) được cung cấp bởi bệnh viện Bạch Mai nhằm kiểm tra độ chính xác, độ nhạy của KIT định lượng kháng nguyên mà chúng tôi sử dụng.
Các mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân sau khi thu về từ bệnh viện Bạch Mai đều được pha loãng 100 lần. Sau đó, tiến hành chạy Real-time PCR với các mẫu trên. Kết quả xác định hàm lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm được trình bày trên hình 3.27 và bảng 3.6.
Hình 3.27. Kết quả định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp
Bảng 3.6. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp
Mẫu Giá trị Cp Nồng độ CYFRA21-1 (ng/ml) HT1 35,56 10,70 HT2 35,92 8,10 HT3 38,41 3,50 HT4 36,49 5,10 HT5 36,07 7,20 HT6 >40,00 <0,26 HT7 >40,00 <0,26 HT8 37,38 2,70 HT9 35,14 15,00 HT10 36,88 2,20 HT11 35,20 14,10 HT12 36,20 6,50 PBS >40,00 <0,26 KN1 35,82 8,70 KN2 >40,00 <0,26 KN3 36,06 7,30 KN4 36,83 3,90 KN5 36,22 6,40 H2O _ _ Từ kết quả ở hình 3.27 và bảng 3.6, chúng tôi nhận thấy: nhiều mẫu bệnh phẩm có tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng ở chu kỳ khá sớm, giá trị hàm lượng CYFRA21-1 của các mẫu phân tích đều tương ứng với tín hiệu
vượt ngưỡng huỳnh quang. Tuy nhiên, các mẫu HT9 và mẫu HT11 có chu kỳ vượt ngưỡng sớm nhất Cp = 35,14 với hàm lượng kháng nguyên CYFRA21-1 tương ứng là 15,0 ng/ml và Cp = 35,20 với hàm lượng kháng nguyên CYFRA21-1 tương ứng là 14,1 ng/ml. Cả hai mẫu huyết thanh này đều có hàm lượng kháng nguyên CYFRA21-1 cao hơn khá nhiều so với mức cho phép (3,3 ng/ml) lưu thông trong máu. Từ đó, chúng tôi cho rằng mẫu HT9 và HT11 có biểu biện của bệnh UTP ở giai đoạn sớm.
Các mẫu HT1 có Cp = 35,56 với hàm lượng CYFRA21-1 là 10,7 ng/ml; mẫu HT2 có Cp = 35,92 với hàm lượng CYFRA21-1 là 8,1 ng/ml; mẫu HT4 có Cp = 36,49 với hàm lượng CYFRA21-1 là 5,1 ng/ml; mẫu HT5 có Cp = 36,07 với hàm lượng CYFRA21-1 là 7,2 ng/ml; mẫu HT12 có Cp = 36,20 với hàm lượng CYFRA21-1 là 6,5 ng/ml; mẫu KN1 có Cp = 35,82 với hàm lượng CYFRA21-1 là 8,7 ng/ml; mẫu KN3 có Cp = 36,06 với hàm lượng CYFRA21-1 là 7,3 ng/ml; mẫu KN5 có Cp = 36,22 với hàm lượng CYFRA21-1 là 6,4 ng/ml. Với kết quả thu được như vậy, chúng tôi nhận thấy rằng: các mẫu HT và KN này đều có hàm lượng CYFRA21-1 cao hơn mức ngưỡng cho phép (3,3 ng/ml) nên cần được theo dõi kỹ; về lý thuyết, các mẫu HT và KN này đã cho thấy nguy cơ bị UTP dạng NSCLC là rất lớn, tuy nhiên để xác định được chính xác hơn nữa thì cần phải có sự theo dõi tiếp theo để có được kết luận chính xác nhất.
Các mẫu khác như HT3, HT6, HT7, HT8, KN2, KN4 đều có hàm lượng dưới ngưỡng cho phép (3,3 ng/ml) hoặc cao hơn không đáng kể, do đó cần phải kết hợp với các phương pháp khác để có được sự chẩn đoán tốt nhất. Xuất phát từ những kết quả trên, chúng tôi nhận thấy, với phương pháp sử dụng real time PCR, có thể định lượng hàm lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong huyết thanh có độ nhạy và cho kết quả chính xác cao ở
mức dưới nanogram (các mẫu HT6, HT7 đều có hàm lượng kháng nguyên CYFRA21-1 nhỏ hơn 0,26 ng/ml). Mặt khác, các giá trị thu được về hàm lượng CYFRA21-1 (ng/ml) trong các mẫu phân tích khá đa dạng, được thể hiện bởi mối quan hệ tỉ lệ thuận giữa hàm lượng CYFRA21-1 trong dịch cơ thể với sự phát triển của tế bào UTP dạng NSCLC. Điều này chứng tỏ việc định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 bằng kỹ thuật Immuno-real time – PCR mà chúng tôi sử dụng đảm bảo được độ tin cậy có thể làm cơ sở tốt cho việc phát triển KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 ứng dụng trong chẩn đoán sớm UTP dạng NSCLC.
Như vậy, phương pháp định lượng kháng nguyên bằng kỹ thuật real time PCR mà chúng tôi sử dụng có độ nhạy và độ chính xác đáng tin cậy trong việc định lượng kháng nguyên CYFRA21-1, đây là cơ sở để có thể tiếp tục hoàn thiện bộ KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 sử dụng trong chẩn đoán sớm UTP dạng NSCLC.
KẾT LUẬN
1. Đã tách dòng thành công đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 từ mẫu bệnh phẩm. Đoạn gen tách dòng có trình tự amino acid suy diễn tương đồng là 100% so với trình tự amino acid của kháng nguyên CYFRA21-1 đã công bố trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế với số đăng ký C1K19_HUMAN P08727.
2. Đã tạo được chủng E. coli BL21/pET-21a(+)/Cyfra21-1 có khả năng sinh tổng hợp protein CYFRA21-1, đã tinh sạch được protein nói trênvà khẳng định bằng phân tích khối phổ.
3. Gây miễn dịch thành công ở gà bằng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 là cơ sở cho việc tạo kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 vận dụng vào việc xây dựng KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong dịch cơ thể.
4. Đã thu nhận được dòng phage biểu hiện kháng thể đơn chuỗi scFv có khả năng liên kết đặc hiệu với epitope của kháng nguyên CYFRA21-1 ở cả 2 dạng: tái tổ hợp và tự nhiên.
5. Bước đầu tạo được KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 bằng kỹ thuật Real time PCR trong dịch cơ thể làm tiền đề cho việc phát triển KIT chẩn đoán sớm UTP dạng NSCLC.
KIẾN NGHỊ
1. Hoàn thiện bộ KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong dịch cơ thể, thiết lập quy trình chẩn đoán UTP dạng NSCLC.
2. Tối ưu hóa điều kiện thu nhận kháng thể scFv hòa tan và khả năng ứng dụng trong điều trị.