- Ghi phổ LCESIMS/MS
3.2.6.Kết quả phân tích khối phổ protein tái tổ hợp
Protein tái tổ hợp sau khi biểu hiện trong E. coli và tinh sạch trên cột Ni-NTA, được xác định cấu trúc bậc I theo phương pháp khối phổ để khẳng định protein thu được chính là CYFRA21-1.
Trong quá trình phân tích khối phổ, sản phẩm sẽđược xử lý bởi trypsin. Như vậy, nếu sản phẩm sau tinh sạch trên cột sắc ký Ni-NTA mà chúng tôi thu được là đoạn chứa epitope kháng nguyên CYFRA21-1 thì khi xử lý với trypsin sẽđược cắt thành các mảnh có kích thước khác nhau.
Theo lý thuyết, trypsin sẽ cắt protein tại các vị trí sau amino acid Arginine I và Lysine (K).
Như vậy, nếu protein nhận được biểu hiện trong thí nghiệm trên là đoạn chứa epitope kháng nguyên CYFRA21-1 thì khi xử lý với Trypsin nhận được 9 mảnh peptide với trình tự tương ứng sau:
MGR/ SEVTDLR/ R/ TLQGLEIELQSQLSMK/
AMINOACIDLEDTLAETEAR/ FGAQLAHIQALISGIEAQLGDVR/ ADSER/ QNQEYQR/ LMDLEHHHHHH
Sau khi tiến hành phân tích khối phổ sản phẩm protein được biểu hiện và tinh sạch nói trên, chúng tôi thu được kết quả trên hình 3.14 và bảng 3.1.
Hình 3.14 Kết quả phân tích khối phổ sản phẩm protein biểu hiện trong E. coli sau khi cảm ứng với IPTG
Kết quả thu nhận được sau khi phân tích khối phổ (Hình 3.14 và Bảng 3.1) cho thấy, các mảnh phân tử (các đoạn peptide) được nhận diện trùng lặp hoàn toàn với tính toán lý thuyết.
Như vậy, sản phẩm của gen tái tổ hợp mã hóa đoạn chứa epitope kháng nguyên CYFRA21-1 được biểu hiện và tinh sạch chính là epitope kháng nguyên CYFRA21-1. Như vậy, chúng tôi đã thành công trong việc thu nhận kháng nguyên CYFRA21-1 làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả nói trên cho thấy, kháng nguyên nhận được sau khi sắc ký trên cột Ni-NTA đảm bảo độ tinh sạch cần thiết để gây miễn dịch ở gà và tiến hành các thí nghiệm miễn dịch tiếp theo. Vị trí vắt Tên enzyme sử dụng Trình tự peptide nhận được thực tế Chiều dài Khối lượng peptide [Da] 3 Trypsin MGR 3 362.447 10 Trypsin SEVTDLR 7 818.882 11 Trypsin R 1 174.203 27 Trypsin TLQGLEIELQSQLSMK 16 1818.115 40 Trypsin AALEDTLAETEAR 13 1389.482 63 Trypsin FGAQLAHIQALISGIEAQLGDVR 23 2407.755 68 Trypsin ADSER 5 576.564 75 Trypsin QNQEYQR 7 964.990 86 LMDLEHHHHHH 11 1442.577