- Ghi phổ LCESIMS/MS
3.1.4.Xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-
Việc xác định trình tự gen tách dòng được tiến hành phản ứng bằng KIT “Big Dye Terminator sequencing KIT” (ABI, Mỹ), chạy trên máy ABI PRISM® 3100-Avant Gentic Analyzer và theo phương pháp của Sanger và cộng sự (1981) [84]. Với cách làm như vậy, chúng tôi thu được trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của sản phẩm nhân bản RT-PCR đã được xác định cụ thể trên hình 3.4 AATTCGCCCTTGAAGGATGCTGAAGCCTGGTTCACCAGCCGGACTGAAGAATTGAACCGGGAGGTCGCTGGC 72 N S P L K D A E A W F T S R T E E L N R E V A G CACACGGAGCAGCTCCAGATGAGCAGGTCCGAGGTTACTGACCTGCGGCGCACCCTTCAGGGTCTTGAGATT 144 H T E Q L Q M S R S E V T D L R R T L Q G L E I GAGCTGCAGTCACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTTGGAAGACACACTGGCAGAAACGGAGGCGCGCTTTGGA 216 E L Q S Q L S M K A A L E D T L A E T E A R F G GCCCAGCTGGCGCATATCCAGGCGCTGATCAGCGGTATTGAAGCCCAGCTGGGCGATGTGCGAGCTGATAGT 288 A Q L A H I Q A L I S G I E A Q L G D V R A D S GAGCGGCAGAATCAGGAGTACCAGCGGCTCATGGACATCAAGTCGCGGCTGGAGCAGGAGATTGCCACCTAC 360 E R Q N Q E Y Q R L M D I K S R L E Q E I A T Y CGCAGCCTGCTCGAGGGACAGGAAGATCACTACAACAATTTGTCTGCCTCCAAGGTCCTCTGA 423 R S L L E G Q E D H Y N N L S A S K V L *
Hình 3.4. Trình tự nucleotide của cDNA và amino acid suy diễn của đoạn gen mã hóa CYFRA21-1
Với trình tự đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 thu được như trên, chúng tôi tiến hành so sánh với trình tự gen mã hóa CYFRA21-1 đã công bố trong Ngân hàng Gen Quốc tế trên trang web http://www.ebi.ac.uk bằng phần mềm FASTA để kiểm định sản phẩm cDNA, kết quả thu được trình bày trên hình 3.5 và phụ lục 6.
Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 thu được với trình tự amino acid của kháng nguyên CYFRA21-1 đã được công bố trong Ngân hàng dữ liệu quốc tế mang mã số K1C19-HUMAN P08727.
Kết quả trên hình 3.5 cho thấy trình amino acid suy diễn của đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 mà chúng tôi nhân bản có sự trùng hợp 100% so với trình tự amino acid của kháng nguyên CYFRA21-1 đã được công bố trong Ngân hàng dữ liệu quốc tế có mã số: K1C19-HUMAN P08727.
Như vậy, có thể khẳng định rằng, chúng tôi đã nhân bản, tách dòng và xác định thành công trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 làm cơ sở đáng tin cậy cho việc biểu hiện và thu nhận protein tái tổ để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.