- Ghi phổ LCESIMS/MS
3.1.2. Nhân bản đoạn gen mã hoá kháng nguyên CYFRA21-
Kết quả nghiên cứu của một số tác giả trên thế giới về gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 cho thấy, gen Cytokeratin19 gồm 6 exon xen kẽ 5 intron và có kích thước khoảng 4667 bp, vùng mRNA mã hóa cho CYFRA21-1 dài khoảng 1382 bp, tuy nhiên vùng dịch mã protein CYFRA21- 1 vào khoảng 1000 bp trong tổng số đó [36], [41], [42], [82].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cặp mồi CYFRAF/R được thiết kế cho đoạn gen mã hóa protein CYFRA21-1 để tiến hành nhân bản cDNA đoạn gen mã hoá CYFRA21-1 từ mRNA có trong RNA tổng số thu được ở trên thông qua phản ứng RT-PCR.
Việc nhân bản cDNA đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 được thực hiện theo KIT “RT-PCR one step” của hãng Invitrogen; với bộ KIT này, gen được nhân bản trực tiếp từ mRNA.
Phản ứng RT-PCR được tiến hành trên máy PCR với chu trình nhiệt như sau:
Giai đoạn tổng hợp cDNA diễn ra ở 50°C trong 30 phút; sau đó gen được khuyếch đại theo chu trình nhiệt 94°C, 15 giây; Tm 57oC: 30 giây; 72oC: 1 phút 20 giây; lặp lại 30 chu kỳ, sản phẩm giữ ở 4°C.
Sản phẩm nhân bản cDNA đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 (sản phẩm phản ứng RT-PCR) được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.
Kết quả điện di trên hình 3.1 cho thấy, trên làn chạy số 1 xuất hiện một băng sáng đậm, so với thang DNA chuẩn thì băng này có kích thước vào khoảng hơn 400 bp. Kết quả này phù hợp với tính toán về độ dài của đoạn gen cDNA mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1.
Như vậy, chúng tôi cho rằng: đoạn gen cDNA mã hoá cho kháng nguyên CYFRA21-1 đã được nhân bản thành công; sau đó, chúng tôi tiến hành tách dòng và xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1 để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.