Sử dụng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-1 thu được để định lượng kháng nguyên CYFRA21-

- Ghi phổ LCESIMS/MS

3.5.Sử dụng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-1 thu được để định lượng kháng nguyên CYFRA21-

lượng kháng nguyên CYFRA21-1

KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong UTP được thực hiện bao gồm:

Tạo các phage biểu hiện scFv của kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1.

Gắn kháng thểđặc hiệu CYFRA21-1 lên các giếng khay thử.

Bổ sung các phage biểu hiện scFv đặc hiệu CYFRA21-1 để tạo phức hợp kháng thể-kháng nguyên-scFv trên phage.

Thủy giải các DNA-phage làm khuôn để định lượng bằng kỹ thuật real- time PCR.

Sở dĩ chúng tôi chọn kỹ thuật Immuno-real time PCR để định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 là bởi kỹ này được dùng để định lượng DNA, RNA trong mẫu phân tích, đây là một kỹ thuật hiện đại có độ chính xác cao, cho phép định lượng các phân tử acid nucleic có trong mẫu phân tích.

Điểm đặc biệt trong phương pháp Immuno-real time PCR là cho phép định lượng protein trong mẫu phân tích. Để làm được việc này, cần phải có sự gắn kết giữa DNA với phân tử kháng thể có khả năng gắn kết đặc hiệu với phân tử kháng nguyên.

Nói cách khác, phải tạo được phức hệ DNA-kháng thể như một phân tử khuôn trong phản ứng Immuno-real time PCR, từ đó gián tiếp định lượng được kháng nguyên trong mẫu phân tích.

Trên nguyên lý này, chúng tôi chọn kháng thể scFv đặc hiệu CYFRA21-1 biểu lộ trên thực khuẩn thể phage thay cho phức hệ DNA-kháng thể, cách lựa chọn này có nhiều ưu điểm:

Dễ dàng tạo dòng phage, trong đó hệ gen của thực khuẩn thể chứa gen mã hóa kháng thể kháng CYFRA21-1 làm khuôn cho phản ứng Real time PCR, trong khi đó kháng thể kháng CYFRA21-1 được biểu lộ trên bề mặt thực khuẩn thể thực hiện chức năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với kháng nguyên CYFRA21-1 trong mẫu phân tích, từ đó có thể định lượng được kháng nguyên CYFRA21-1 trong mẫu phân tích.

Mặt khác, tính bền vững của phage sẽ mang lại hiệu quả cao trong quá trình phân tích, kỹ thuật Immuno-Real time PCR có độ nhạy và độ chính xác cao.

Để tiến hành phân tích định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong các mẫu mà chúng tôi thu về, trước hết cần phải xây dựng làn chuẩn nồng độ và để đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng so với việc sử dụng SYBR green I, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng probe No115 của Hãng Roche để thực hiện Real-time PCR.

Cụ thể, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi CyfprobF/R để khuếch đại đoạn gen mã hóa scFv của kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 và probe No115 được sử dụng để khuếch đại đoạn DNA mã hóa cho scFv đã gắn trong hệ gen của phage (Hình 3.23). Ngoài ra, các thành phần phản ứng còn có 0.5 µl QuantiTect RT Mix, 5 µl DNA khuôn (dịch thuỷ giải phage); 1 µl Uracil-N- glycosylase, heat-labile, 17,5 µl Rnase-free water. Mẫu đối chứng âm tính không chứa DNA khuôn.

Chu trình nhiệt của phản ứng (Hình 3.24)

Hình 3.24. Sơ đồ mô tả chu trình nhiệt trong phản ứng real time PCR

94oC trong 5 phút

50 chu kỳ: 95oC thời gian 45 giây 55oC thời gian 70 giây.

Hình 3.23. Sơ đồ mồi, mẫu dò và đoạn DNA được khuếch đại trong phản ứng định lượng kháng nguyên CYFRA21-1

Sau khi xây dựng làn chuẩn lặp lại 2 lần với các mẫu có ký hiệu S1, S2, S3, S 4, S5 là các mẫu chuẩn có nồng độ kháng nguyên xác định. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên các mẫu huyết thanh (HT), kháng nguyên (KN) của bệnh nhân thu về đã được pha loãng (pha loãng 100 lần), nhằm kiểm nghiệm độ nhạy, độ tin cậy của KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 mà chúng tôi thực hiện.

Kết quả định lượng CYFRA21-1 bằng kỹ thuật Real time PCR được trình bày trên hình 3.25 và bảng 3.5

Hình 3.25. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu huyết thanh, kháng nguyên

Mẫu Giá trị CP Nồng độ của nguyên CYFRA21-1 (ng/ml) KN1 38,03 6,13 E0 HT1 42,31 1,33 E-1 HT2 40,55 5,89 E-2 HT3 41,28 3,84 E-2 HT4 39,83 3,64 E-1 HT5 41,59 1,02 E-2 BL 40,62 7,56 E-2

Kết quả trên hình 3.25 và bảng 3.5 cho thấy, ngoài các mẫu chuẩn (S1, S2, S3, S4, S5) có chu kỳ vượt ngưỡng tương đối đều, các mẫu được thử nghiệm đều cho các giá trị kết quả khác nhau và tương ứng với giá trị vượt ngưỡng của từng mẫu. Do vậy, chúng tôi cho rằng, kỹ thuật real-time PCR với probe No115 của Hãng Roche (hình 3.23) là rất đặc hiệu, cho phép định lượng chính xác hàm lượng CYFRA21-1 trong các mẫu huyết thanh đã phân tích.

Để kiểm nghiệm độ nhạy, độ đặc hiệu và sự tin cậy của KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1, chúng tôi tiếp tục tiến hành thử nghiệm trên các mẫu HT bệnh nhân đã xác định là UTP và mẫu HT của người không bị mắc bệnh UTP (người bình thường), (mẫu do bệnh viện Trung ương Quân đội 108 cung cấp). Trong đó các mẫu HT 1, HT 2, HT 3, HT 4 là các mẫu đã xác định UTP dạng NSCLC, HT 5 là mẫu của người bình thường. Sau khi thực hiện

Bảng 3.5. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu huyết thanh, kháng nguyên

định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 của các mẫu huyết thanh trên, chúng tôi thu được kết quả trình bày trên hình 3.26.

Từ kết quả thể hiện trên hình 3.26 chúng tôi thấy: các mẫu HT1, HT2, HT3, HT4 (mẫu huyết thanh của người bị bệnh) đều có lượng kháng nguyên CYFRA21-1 cao hơn ngưỡng (3,3 ng/ml) rất nhiều. Trong khi đó mẫu huyết thanh HT5 (mẫu huyết thanh của người khỏe không bị bệnh) có lượng kháng nguyên CYFRA21-1 rất thấp (dưới ngưỡng 3,3 ng/ml). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với những nghiên cứu của một số tác giả trên thế giới [25], [43], [66], điều này cho thấy: kháng thể phage-scFv mà chúng tôi tạo ra có giá trị ứng dụng cao trong việc định lượng kháng nguyên CYFRA21-1. Đồng thời cũng cho thấy, việc sử dụng KIT định lượng kháng nguyên mà chúng tôi đề xuất để chẩn đoán UTP đạt kết quả tốt và góp phần hữu ích trong việc điều trị căn bệnh nguy hiểm này.

Hình 3.26. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu huyết thanh do bệnh viện Trung ương Quân đội 108 cung cấp