- Ghi phổ LCESIMS/MS
2.2.4.4.Sàng lọc dòng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-
Có rất nhiều phương pháp để thực hiện việc sàng lọc, tùy thuộc vào đích cần sàng lọc. Kháng nguyên CYFRA21-1 có bản chất là một phân tử
protein và tương đối dễ dàng được hấp thụ trên bề mặt đĩa polystyrene. Chính vì vậy, chúng tôi chọn cách đơn giản để cố định kháng nguyên trong quá trình sàng lọc kháng thể phage-scFv đặc hiệu CYFRA21-1. Quy trình như sau:
- Kháng nguyên pha loãng trong PBS (10-100 ng) sau đó được phủ trên đĩa polystyrene qua đêm ở nhiệt độ phòng.
- Để tránh phage liên kết không đặc hiệu với bề mặt, đĩa được phủ tiếp với dung dịch MPBS 2% sữa tách bơ và ủ ở 37oC trong 2 giờ.
- Rửa đĩa bằng PBS 3 lần sau đó cho hỗn hợp phage (đã nhân nuôi từ thư viện gốc Bacteriophage Griffin.1 theo phương pháp 2.2.3.2) vào các giếng.
- Ủ đĩa 37oC trong 2 giờ. Sau đó rửa 10 lần bằng dung dịch TPBS (0,05% Tween 20 pha trong PBS), rửa tiếp 10 lần với dung dịch PBS.
- Các phage gắn với kháng nguyên được giải hấp thụ bằng 1 ml triethylamine 100 mM trong 10 phút ở nhiệt độ phòng sau đó trung hòa bằng 0,5 ml Tris-HCl, pH=7,5.
- Dung dịch phage giải hấp thụ được ly tâm 10.000 vòng/phút, thu dịch ly tâm. Dịch ly tâm chứa các phage mang mảnh kháng thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên CYFRA21-1.
- Các phage sau mỗi vòng sàng lọc sẽ được nhân nuôi trong tế bào TG1 để phục vụ cho các vòng sàng lọc tiếp theo. Sau lần sàng lọc thứ 3 ái lực trung bình của các kháng thể phage-scFv được kiểm tra bằng ELISA với kháng thể cộng hợp kháng M13.