- Ghi phổ LCESIMS/MS
3.4.3.Quy trình tạo dòng phage biểu hiện kháng thể scFv (kháng thể phage)
phage)
Trên thế giới, kỹ thuật phage-display được các nhà khoa học sử dụng để tạo ra được rất nhiều đoạn kháng thể đơn chuỗi ở dạng tái tổ hợp có khả năng kháng lại một lượng lớn các kháng nguyên khác nhau, chẳng hạn RNA, kháng nguyên protein, các proteoglycan, ... [19], [81], [104].
Để tạo kháng thể phage-scFv, trước hết phải xây dựng thư viện phage- scFv dựa trên quy trình mà tiến sĩ Griffith và cộng sự tại trung tâm MRC, Cambridge, Vương Quốc Anh đã xây dựng năm 1991.
Kỹ thuật này tạo ra kháng thể một cách hoàn toàn in vitro, đơn giản, nhanh và giá thành rẻ [28]. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật phage-display để tạo kháng thể scFv dạng tái tổ hợp kháng CYFRA21-1 làm cơ sở cho việc phát triển KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong dịch cơ thể, góp phần chẩn đoán sớm UTP dạng NSCLC.
Cụ thể:
Thu nhận ngẫu nhiên 24 dòng (khuẩn lạc) tế bào E. coli TG1 từ các đĩa biến nạp ở trên và nuôi trong 100 µl môi trường 2xTY (gồm 16g Typtone, 10g Yeast Extract và 5g NaCl trong 1 lit nước) chứa 100 µg/ml ampicillin và glucose 1%. Nuôi lắc ở 37oC qua đêm, sau đó bổ sung 100 ml môi trường 2xTY chứa 100 µg/ml ampicillin và glucose 1% và nuôi cho tới khi đạt OD600 = 0,5 (khoảng 2 giờ).
Gây nhiễm các tế bào E. coli trong dịch nuôi cấy với helper phage M13-K07 (BioLab) theo tỷ lệ 1:20 (số tế bào vi khuẩn: số hạt helper phage). Tiếp tục nuôi không lắc trong bể nước ở 37oC với thời gian khoảng 30 phút. Ly tâm 3.300 x g trong 10 phút. Cặn ly tâm được hòa trong 50 ml môi trường 2xTY chứa 100 µg/ml Ampicillin và 25 µg/ml Kanamycin và nuôi ủ lắc qua
đêm ở 37 C. Ly tâm 10.800 x g trong 10 phút hoặc 3.300 x g trong 30 phút. Thêm 1/5 thể tích PEG/NaCl (20% Polyethylene glycol 6.000 và 2,5 M NaCl) vào phần dịch ly tâm. Trộn đều và để tủa ở 4oC, thời gian 1 giờ. Ly tâm 10 800 x g trong 10 phút hoặc 3.300 x g trong 30 phút. Loại bỏ dịch ly tâm, ly tâm nhanh và loại bỏ hoàn toàn dịch ly tâm.
Hòa cặn ly tâm trong 2 ml PBS và ly tâm 11.600 x g trong 10 phút để loại bỏ hoàn toàn xác tế bào. Dịch ly tâm thu được là dịch phage biểu hiện scFv trên bề mặt.
Tuy nhiên, để thu nhận kháng thể phage-scFv đặc hiệu có khả năng nhận biết và gắn kết với epitope kháng nguyên, cần tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA.