- Ghi phổ LCESIMS/MS
3.2.4.Biểu hiện protein CYFRA21-1 tái tổ hợp
Sau khi thu được vector biểu hiện tái tổ hợp (pET-21a(+)/CYFRA21-1) mang đoạn gen mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1, chúng tôi tiến hành biểu hiện protein CYFRA21-1 trong E. coli để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Vector biểu hiện pET-21a(+) mang đoạn gen mã hoá vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 được biến nạp vào chủng E. coli BL21 (DE3) để biểu hiện.
Cụ thể:
Chủng E. coli BL21(DE3) được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng chứa 100 µl/ml ampicillin.
Tế bào được nuôi qua đêm ở điều kiện lắc nhẹ 200 vòng/phút, 37oC. Bổ sung 1% dịch nuôi qua đêm vào môi trường mới và nuôi tiếp cho đến khi đạt OD600 = 0,6. Thu một phần dịch nuôi để làm mẫu trước cảm ứng, phần còn lại cảm ứng bằng IPTG nồng độ 1 mM.
Mẫu không cảm ứng và cảm ứng được nuôi lắc trong cùng điều kiện, lắc 200 vòng/phút, ở 37oC, thu mẫu để phân tích sau thời gian nuôi lần lượt là 2 giờ, 3 giờ, 5 giờ và 20 giờ.
Tốc độ sinh trưởng của tế bào chứa vector tái tổ hợp dưới tác động của chất cảm ứng IPTG tăng lên nhanh chóng so với mẫu không cảm ứng sau thời gian nuôi thích hợp (Phụ lục 9, phụ lục 10).
Sau đó, thu tế bào tại các thời điểm khác nhau và được xử lý để kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide theo phương pháp của Laemmli (Hình 3.12).
Theo tính toán, đoạn protein chứa epitope kháng nguyên CYFRA21-1 mà chúng tôi thu nhận có kích thước khoảng 8 kDa, sẽ có băng thấp hơn Lysozyme (14 kDa).
Trên bản điện di (Hình 3.12), trừ làn chạy số 1 là mẫu trước cảm ứng, còn các mẫu không cảm ứng và có cảm ứng được xếp theo cặp cùng thời gian thu mẫu (2; 3; 5 và 20 giờ).
Ảnh điện di (Hình 3.12) cho thấy, tất cả các mẫu được cảm ứng bằng IPTG ở các làn chạy số 3; 5; 7 và số 9 đều xuất hiện một băng thấp hơn lysozyme rất đậm so với mẫu không cảm ứng và có kích thước khoảng 8 kDa so với lysozyme 14 kDa.
Như vậy, chúng tôi cho rằng: sản phẩm protein được biểu hiện có thể là protein CYFRA21-1. Tuy nhiên, để khẳng định băng protein xuất hiện trên ảnh điện di sau khi cảm ứng IPTG có phải là sản phẩm CYFRA21-1 hay không, chúng tôi tiến hành tinh sạch bằng sắc ký ái lực trên cột Ni- NTA agarose.
Hình 3.12. Hình ảnh điện di protein tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli
Làn chạy số 1: Mẫu trước khi cảm ứng với IPTG
Các làn chạy số 2; 4; 6; 8: Mẫu trước cảm ứng với IPTG sau 2; 3; 5 và 20 giờ Các làn chạy số 3; 5; 7; 9: Mẫu cảm ứng bằng IPTG sau 2; 3; 5 và 20 giờ Làn chạy M: lysozyme, 14 kDa