C ấu trúc của thực khuẩn thể M
2.1.2Sinh phẩm và hóa chất
- Gà dùng để gây miễn dịch
- Tủy xương và lách gà đã gây miễn dịch
Sinh phẩm
+ Cặp mồi dùng trong việc tách dòng đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1
CyfraF: 5’-GAAGGATGCTGAAGCCTGGTTC-3 CyfraR: 5’-TACCCAGAAGACACCCTCCAAAGG-3’.
+ Cặp mồi sử dụng để biểu hiện đoạn gen mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1
ExpcyF: 5’ -CATATGGGCAGGTC-3’
ExpcyR: 5’-CTCGAGGTCCATGAGCCGCTGGTAC-3’
+ Vector tách dòng PCR2.1-TOPO do hãng Invitrogen cung cấp. Cặp mồi M13F/M13R để xác định đoạn gen CYFRA21-1 có trong E. coli có trình tự như sau: M13F: 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’
M13R: 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’
+ Vector biểu hiện pET-21a(+) (hãng Novagen). Cặp mồi T7F/R để xác định gen ngoại lai gắn vào vector, trình tự như sau:
T7F: 5’-TTAATACGACTCACTATAGG-3’ T7R: 5’-CCGCTGAGCAATAACTAG-3’
+ Dòng tế bào E. coli BL21 (DE3), DH5α do Trung tâm Công nghệ Protein của Vương Quốc Anh (MRC-Centre for Protein Engineering,
Cambridge, UK) cung cấp. Cặp mồi LabF/R dùng để nhân bản, khuếch đại thư viện thực khuẩn sau mỗi vòng sàng lọc, trình tự cụ thể như sau:
LabF: 5’-CAGGAACAGCTATGAC- 3’ LabR: 5’-GAATTTTCTGTATGAGG- 3’ + Helper phage M13K07 (Invitrogen, CA, USA).
+ Các bộ KIT tách RNA “S.N.A.P”; KIT RT-PCR “one step RT-PCR”; bộ KIT tách dòng “TA-Topo Cloning KIT; KIT tách plasmid từ vi khuẩn của hãng QIAgen; KIT real time-PCR của Roche; KIT tinh sạch thu đoạn DNA từ gel agarose của hãng Bioscience; KIT Big Dye Terminator sequencing …”
+ Các enzym: Taq DNA polymease, Nde I, EcoR I, Xho I, T4 DNA, ligase, … Các sinh phẩm này do hãng BioLabs cung cấp.
+ Cặp mồi được sử dụng để thu nhận gen mã hóa vùng biến đổi chuỗi nặng và vùng biến đổi chuỗi nhẹ của kháng thể kháng CYFRA21-1 CSVCHO-F: 5’-GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGCCGTGACGTTGGACGAG-3’ CSCG-R: 5’-CTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC-3’ CSCVK: 5’-GTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC-3’ CKJO-R: 5’-GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCAGG-3’
+ Cặp mồi định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 CyfproF: 5’-GGCGGTAGTGCACTTGAGA-3’ CyfproR: 5’-AAGGGTGACAGGTGAGGAGA-3’ + Các chủng E. coli TOPO10, BL-21 (DE3) Star.
+ Các protein CYFRA21-1 chuẩn (Sigma)
+ Kháng thể cộng hợp kháng M13 (anti-M13 horseradish peroxidase- conjugate, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).
Hóa chất
- Bộ hóa chất chạy real time Maxima SYBR Green Master Mix (Fermentas).
- Hóa chất dùng để nuôi cấy và chọn lọc vi sinh vật: Cao nấm men (yeast extract), Tryptone (Difco, Mỹ), Glucose, NaCl, NaOH, Agar Bacto, các chất kháng sinh Kanamycine, Ampicilin, chất cảm ứng IPTG, chất chỉ thị X-gal.
- Hóa chất dùng trong thao tác với DNA và RNA: Agarose, Acetic acid, Tris-base, EDTA, EtBr, Ethanol, Trizol, Chloroform, Isoamylalcohol, Isopropanol.
- Hóa chất thao tác với phage: PEG 6.000, Triethylamin, …
- Hóa chất ELISA: H3P04, NaH2P04, Na2HP04, NaCl, NaOH, TMB, Tween-20.
- Hóa chất thao tác với protein: Acrylamide, Bisacrylamide, SDS, Glycerol, Tris-base, Methanol, Acetic acid, Bromophenolblue, Comassie brilliant blue. Các hóa chất này chủ yếu do hãng Sigma cung cấp.
2.1.3. Thiết bị
Lò vi sóng (Samsung); Máy PCR, Máy lắc ổn nhiệt 370C; Máy khuấy từ (RotoLab, OSI); Máy ly tâm (Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ); Tử lạnh sâu (- 200C, -850C) hãng Sanyo Nhật Bản; Máy khuấy trộn Đảo nhẹ (RotoLab, OSI); Máy quang phổ Shimadzu (Nhật Bản); Máy soi chụp ảnh gel (Bio-Rad); Cân phân tích 10-4g (Mettler Toledo); Bộ nguồn nhiệt di (Bio-Rad); Tủ cấy vô trùng (Sanyo); Pipettman các loại (Gilson); Nồi khử trùng (Nhật Bản); Cân phân tích 10-2g; Máy ly tâm lạnh (Sorvall Biofuge Frerco); Bộ điện di DNA Advance Tech (Nhật Bản); Máy xác định trình tự DNA tự động (ABI 3100, Applied Biosystems, Mỹ); Nanodrope và các thiết bị khác.
Các thí nghiệm được thực hiện chủ yếu tại Phòng thí nghiệm trọng điểm, Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});