Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1
3.1.3. Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1
Sau khi nhân bản thành công đoạn gen cDNA bằng phản ứng RT-PCR, để khẳng định kết quả RT-PCR là độ dài của đoạn gen mã hóa CYFRA21-1, chúng tôi tiến hành tách dòng và xác định trình tự đoạn gen đã được nhân
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose
Làn chạy số 1: Sản phẩm RT-PCR Làn chạy M: Marker DNA 1kb
Sản phẩm
RT-PCR ≈ 400 bp 500 bp
M 1
250 bp
bản, sau đó so sánh với trình tự gen mã hóa CYFRA21-1 đã công bố trong Ngân hàng giữ liệu gen Quốc tế.
Quy trình tách dòng được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm phản ứng RT-PCR vào vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen), (sơ đồ vector pCR2.1 được trình bày ở phụ lục 4)
Phản ứng gắn sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng được thực hiện với mục đích tạo vector tái tổ hợp mang đoạn DNA cần tách dòng. Thành phần phản ứng gắn sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng đã được trình bày ở phần phương pháp.
Nguyên tắc của phản ứng này là dựa trên việc tạo ra một gốc Adenin tự do đầu 3’ trên sản phẩm của enzym Taq mà không phụ thuộc vào trình tự khuôn, trong khi đó một gốc Thymine tự do được thiết kế trên vector tách dòng pCR2.1. Điều này cho phép sản phẩm RT-PCR có thể gắn vào vector dễ dàng hơn khi có mặt của enzym xúc tác.
Trong phản ứng gắn sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng, enzym topoisomerase (có trong bộ “TA Cloning KIT”), sẽ bám vào DNA tại một vị trí đặc hiệu và cắt bỏ liên kết phosphodieste ở đầu 5’-CCCTT trên một chuỗi đơn của vector, đồng thời tạo nên liên kết cộng hóa trị giữa gốc phosphat đầu 3’ của chuỗi vừa bị cắt với tyrosine tại vị trí 274 của enzym topoisomerase bằng chính năng lượng của liên kết phosphodieste.
Tiếp theo, liên kết giữa gốc phosphat của DNA và tyrosine của enzym bị phá vỡ nhờ tác động của nhóm 5’-OH của sợi đơn đã bị cắt trước đó, điều này sẽ làm chuyển hướng phản ứng và giải phóng enzym topoisomerase (Phụ lục 5)
Với các thao tác như trên, chúng tôi thu được vector tái tổ hợp mang đoạn gen cDNA mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 (sản phẩm RT-PCR).
Sau đó, sản phẩm RT-PCR khi được gắn với vector tách dòng sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng TOP10, tiếp theo, chúng tôi chọn dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp mang gen đích bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi M13F/R, các dòng đã chọn được tách chiết plasmid và điện di kiểm tra trên gel agarose (Hình 3.2).
Làn chạy M: Marker DNA 1 kb (Fermentas)
Làn chạy số 1, số 2: DNA plasmid chứa đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 Ảnh điện di (Hình 3.2) cho thấy, các plasmid chứa đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 trên làn chạy số 1 và số 2 của băng điện di đều tương đối sạch, hàm lượng cao và có kích thước vào khoảng hơn 4,3 kb so với thang DNA chuẩn. Mặt khác, kích thước của vector tách dòng pCR2.1 là 3,9 kb, kích thước của sản phẩm RT-PCR vào khoảng 400 bp. Như vậy, kích thước của các plasmid chứa đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 ở làn chạy số 1 và số 2 cho
M 1 2
2 kb 1 kb 3 kb 4 kb
Hình 3.2. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa CYFRA21-1
4,3 kb
thấy các plasmid nói trên có đủ điều kiện đảm bảo cho việc thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Sau đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm gắn RT-PCR vào vector tách dòng pCR2.1 bằng cách: sử dụng enzym cắt hạn chế EcoR I để xử lý plasmid tách từ khuẩn lạc trắng và kiểm tra bằng phương pháp điện di.
Kết quả được biểu hiện trên hình 3.3.
Kết quả trên hình 3.3 cho thấy, trên làn số 1 là DNA plasmid tách từ khuẩn lạc trắng được xử lý bằng enzym EcoR I đã xuất hiện một đoạn DNA có kích thước tương đương kích thước của sản phẩm RT-PCR và kích thước này vào khoảng hơn 400 bp khi so với DNA chỉ thị marker DNA 1kb. Kích thước này hoàn toàn phù hợp với kích thước của sản phẩm RT-PCR ở làn chạy số 2.
Như vậy, có thể khẳng định rằng: sản phẩm RT-PCR đã gắn được vào vector tách dòng pCR2.1; nói cách khác, kết quả tách dòng gen mã hoá
Sản phẩm RT-PCR
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách dòng đoạn gen mã hóa CYFRA21-1
Làn chạy số M: Marker DNA 1 kb (Fermentas)
Làn chạy số 1: DNA plasmid được cắt bởi enzym EcoR I Làn chạy số 2: Sản phẩm RT-PCR
M 1 2
500bp 250bp
CYFRA21-1 đã được chúng tôi thực hiện thành công. Tuy nhiên, để xác định rừ sản phẩm RT-PCR đỳng là đoạn gen mó húa CYFRA21-1, chỳng tụi tiếp tục tiến hành xác định trình tự của sản phẩm RT-PCR, sau đó so sánh với trình tự gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 đã được công bố trên Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế.