C ấu trúc của thực khuẩn thể M
2.2.2.1. Tách chiết RNA từ bệnh phẩm
Quá trình tách chiết RNA được thực hiện theo (KIT S.N.A.P của hãng Invitrogen) trong điều kiện các dụng cụ đều được xử lý bằng DEPC 0,1% qua đêm để loại bỏ Rnase. Sau đó khử trùng hơi trong nồi hấp tiệt trùng 121oC, 1atm thời gian 45 phút).
Bệnh phẩm UTP sau khi nhận từ bệnh viện về, chúng tôi tiến hành tách ngay RNA tổng số theo quy trình sau:
Trước hết, chúng tôi tách tế bào lympho từ máu theo các bước sau: -Trộn 1 thể tích máu toàn phần và 5 thể tích buffer EL ủ 10-15 phút trên đá (trong thời gian này lắc đều 2 lần).
-Ly tâm 2000v/phút trong 10 phút ở 4oC, sau đó loại dịch chứa tế bào. -Thêm buffer EL vào cặn tế bào (tế bào lympho) theo tỉ lệ 2 thể tích buffer: 1 thể tích máu, trộn đều.
-Ly tâm 2000v/phút trong 10 phút ở 4oC, loại dịch và thu tế bào lympho. Sau khi tách tế bào lympho từ máu toàn phần, chúng tôi tiến hành tách RNA tổng số theo các bước sau:
Bước thứ nhất: Tách acid nucleic tổng số
- Lấy 200 µl máu vào ống eppendoft sạch Rnase. - Bổ sung proteinase K.
- Đảo nhẹ 30 giây, ủ 20 phút ở 37oC. - Ly tâm 12.000 vòng/phút, thu dịch. - Bổ sung 400 µl isopropanol, đảo đều. - Chuyển dịch sang cột S.N.A.P.
- Ly tâm 1 phút, 12.000 vòng/phút, bỏ dịch ly tâm. - Rửa 2 lần bằng dung dịch rửa 1X.
- Sau 2 lần rửa ly tâm cột trong thời gian 2 phút để loại hết dịch. - Dùng 135 µl nước không chứa Rnase để thu acid nucleic tổng số.
Bước thứ hai: Loại DNA
- Thêm 15 µl đệm 10X và 1 µl (2 đơn vị) DNase (không chứa RNase). - Ủ 37oC trong 10 phút.
- Thêm 450 µl đệm gắn kết, đảo ngược ống 5-6 lần. - Thêm 300 µl Isopropanol và đảo ống 5-6 lần. - Chuyển dịch vào cột S.N.A.P mới.
- Ly tâm tốc độ tối đa trong 1 phút. Loại dịch ly tâm. - Rửa 2 lần bằng dung dịch rửa 1X.
- Dùng 125 µl nước để thu RNA tổng số.