- Ghi phổ LCESIMS/MS
2.2.4.8. Phương pháp phage display immuno real time-PCR
Phage display immuno real time-PCR gián tiếp được thực hiện với các bước như phản ứng ELISA nhưng có một đặc điểm khác biệt là đĩa được tiến hành PCR thay cho phản ứng của enzym. Sau khi ủ với phage, đĩa được rửa với dung dịch đệm ET-PBS (chứa 5 mM EDTA và 0,1% Tween-20) và rửa với H2O để loại bỏ phage không bám. Sau khi rửa, thêm 50 µl H20 vào mỗi giếng và đĩa sau đó sẽ được xử lý nhiệt ở 95oC để phân giải liên kết của phage. Hỗn hợp PCR chứa 5 µl dung dịch thủy giải phage làm khuôn.
Đoạn gen có kích thước ∼ 400 bp được khuếch đại nhờ cặp mồi đặc hiệu anticyfraF và anticyfraR:
Phản ứng real time-PCR rất nhạy, do vậy để tránh trường hợp dương tính giả do tạp nhiễm từ môi trường, phải có một mẫu đối chứng âm NTC (non-template control), mẫu này có đầy đủ các thành phần giống như 1 phản ứng real time-PCR, chỉ thiếu DNA khuôn.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng real time-PCR
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 4,4
Mồi xuôi (10 pmol/µl) 0,3
Mồi ngược (10 pmol/µl) 0,3
SYBR Green Master Mix 10
Kháng thể phage-scFv 5
Tổng thể tích 20
Sau khi chuẩn bị xong các phản ứng, ly tâm nhẹ và cuối cùng đặt vào máy Eppendorf để chạy.
Chu kỳ nhiệt của phản ứng.
Bước 1: Biến tính ở 95oC trong thời gian 15 phút.
Bước 2: Chu trình lặp lại 40 chu kỳ (95oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây) đồng thời có phân tích định lượng.
Bước 3: Xác định nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm real time – PCR (Melting Curves), 95oC, 65oC trong thời gian 10 giây, 95oC đồng thời có phân tích đường cong nóng chảy và đỉnh nhiệt độ nóng chảy.
Bước 4: Làm mát sản phẩm real time-PCR, 40oC trong thời gian 1 phút. Phản ứng khuếch đại có thể quan sát được nhờ tín hiệu huỳnh quang của SYBR Green I phát ra khi bám vào sợi DNA mạch kép từ khi phản ứng khuếch đại bắt đầu cho đến khi kết thúc, thông qua một hệ thống camera theo dõi tín hiệu phát huỳnh quang từ mỗi ống.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN