- Ghi phổ LCESIMS/MS
3.3.Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CYFRA21-
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng gà làm động vật gây miễn dịch bằng kháng nguyên tái tổ hợp thu được từ bệnh phẩm. Sở dĩ chúng tôi sử dụng gà vì trong quá trình tiến hóa, các protein của động vật có vú thường có tính bảo thủ cao, do đó khi sử dụng gà để gây miễn dịch sẽ có phản ứng đáp ứng miễn dịch mạnh hơn so với việc gây miễn dịch trên thỏ hoặc chuột. Mặt khác, phân tử kháng thể của gà IgY có cấu trúc và tính chất giống với IgG ở người [4].
Quy trình gây miễn dịch ở gà được tiến hành như sau: 3 con gà được gây miễn dịch theo phương pháp của Nader S. và William A. F. (1998) với kháng nguyên tái tổ hợp CYFRA21-1.
Epitope kháng nguyên CYFRA21-1 đã tinh sạch được trộn với tá dược (lần đầu dung dịch kháng nguyên được trộn với complete Freund’s adjuvant và các lần sau với incomplete Freund’s adjuvant theo tỉ lệ 1:1) tiêm dưới da 4 lần, mỗi lần cách nhau 1 tuần.
Trước khi giết gà để lấy tuỷ và lách để tách RNA, các mẫu huyết thanh gà được kiểm tra đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp ELISA.
Việc kiểm tra đáp ứng miễn dịch ở gà với epitope kháng nguyên CYFRA21-1 bằng phương pháp ELISA được thực hiện qua 2 giai đoạn.
Giai đoạn 1:
Kiểm tra đáp ứng miễn dịch trong các mẫu huyết thanh gà trước khi gây miễn dịch lần thứ 4. Giai đoạn này nhằm đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà, làm cơ sở cho việc gây miễn dịch lần thứ 4.
Kết quả xác định đáp ứng miễn dịch của gà đã gây miễn dịch với epitope kháng nguyên CYFRA21-1 sau khi gây miễn dịch lần thứ 3 được trình bày trên bảng 3.2 và hình 3.15
Bảng 3.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA sau khi gây miễn dịch lần thứ 3
Giá trị hấp thụ OD Nồng 450nm độ huyết thanh Gà 1 Gà 2 Gà 3 Gà 4 PBS A 2,015 1,350 1,461 0,484 0,044 B 0,913 0,705 0,789 0,531 0,046 C 0,525 0,247 0,544 0,228 0,046 D 0,168 0,081 0,226 0,097 0,045
Gà 1, gà 2 và gà 3: Đã gây miễn dịch lần thứ 3 được kiểm tra đáp ứng miến dịch bằng độ hấp thụ bước sóng 450 nm.
Gà 4: Không gây miễn dịch với kháng nguyên CYFRA21-1. PBS: Không có huyết thanh gà.
A: Huyết thanh không pha loãng B: Huyết thanh pha loãng 10 lần C: Huyết thanh pha loãng 100 lần D: Huyết thanh pha loãng 1000 lần.
Hình 3.15. Biểu đồ xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA sau khi gây miễn dịch lần thứ 3
Từ kết quả thu được từ bảng 3.2 và hình 3.15 cho thấy, đáp ứng miễn dịch của gà với epitope kháng nguyên CYFRA21-1 là rất tốt, đủ tin cậy để tiếp tục gây miễn dịch lần thứ 4.
Giai đoạn 2:
Kiểm tra đáp ứng miễn dịch trong các mẫu huyết thanh gà sau khi gây miễn dịch lần thứ 4, trước khi giết gà lấy tủy và lách. Giai đoạn này nhằm đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà làm cơ sở cho việc thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1.
Kết quả xác định đáp ứng miễn dịch của gà đã gây miễn dịch với epitope kháng nguyên CYFRA21-1 sau khi gây miễn dịch lần thứ 4, trước khi giết gà lấy tủy và lách được trình bày trên bảng 3.3 và hình 3.16
Giá trị hấp thụ OD Nồng 450nm độ huyết thanh Gà 1 Gà 2 Gà 3 Gà 4 PBS C 2,714 2,029 2,133 0,500 0,059 D 0,433 0,438 0,544 0,162 0,057
Gà 1, gà 2 và gà 3: Đã gây miễn dịch lần thứ 4, được kiểm tra đáp ứng miễn dịch bằng độ hấp thụ bước sóng 450 nm, trước khi lấy tuỷ xương và lách để tách RNA.
Gà 4: Không gây miễn dịch với epitope kháng nguyên CYFRA21-1. PBS: Không có huyết thanh gà.
C: Huyết thanh của gà pha loãng 100 lần. D: Huyết thanh của gà pha loãng 1000 lần.
Bảng 3.3. Kết quả xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA trước khi lấy tuỷ xương và lách
Kết quả xác định đáp ứng miễn dịch trên (Bảng 3.3 và Hình 3.16) cho thấy, các gà gây miễn dịch bằng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 sau lần thứ 4 cho kết quả cao.
Mẫu huyết thanh pha loãng 1000 lần vẫn cho kết quả đáp ứng miễn dịch khác biệt rõ rệt với mẫu đối chứng. Điều đó có nghĩa là phản ứng đáp ứng miễn dịch ở gà khi gây miễn dịch với epitope kháng nguyên CYFRA21-1 là rất tốt.
Kết quả của chúng tôi thu được cũng phù hợp với kết quả mà Jos Raats và cộng sự (2003) [78] khi gây miễn dịch gà trực tiếp bằng các haptens để tạo kháng thể đơn dòng có bản chất từ gà hoặc Jennifer và cộng sự (2000) [51] đã gây miễn dịch gà trực tiếp bằng các peptide để tạo thư viện các kháng thể có bản chất từ gà.
Như vậy, gây miễn dịch gà với epitope kháng nguyên CYFRA21-1 sẽ cho đáp ứng miễn dịch cao. Đây là cơ sở tin cậy để chúng tôi tiến hành thu nhận kháng thể có bản chất từ gà kháng kháng nguyên CYFRA21-1 đảm bảo cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.16. Biểu đồ xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA trước khi lấy tuỷ xương và lách