Để xác định NST giới tính, khảo sát locus SRY của NST Y và locus Amelogenin hiện diện với kích thước khác nhau ở NST X và NST Y. Tuy nhiên, sẽ có một số trường hợp đồng hợp tử các alen trên NST X dẫn đến không thể kết luận được. Lúc này kit Devyser cịn có thêm những marker có sự kết hợp giữa NST giới tính X và NST thường như 7X, T2 để xác định rõ giới tính. Ví dụ marker 7X thể hiện mối tương quan giữa NST số 7 và NST X. Khi thai mang 2 NST giới tính X marker này sẽ thể hiện tỉ lệ đỉnh alen là 1:1, khi thai mang 1 NST X trong trường hợp giới tính nam hay HC Turner XO thì tỉ lệ đỉnh alen là 2:1 (hình 2.4). Đây chính là một trong những ưu điểm của kit Devyser [25].
A B Hình 2.4. Marker 7X [25]
A: Tỉ lệ alen 1:1, B: Tỉ lệ alen 2:1
Quy trình:
� Tổng thể tích của các hỗn hợp phản ứng PCR đều là 25µl, bao gồm: � Hỗn hợp PCR: 20µl
� Các phản ứng PCR được chạy theo chu trình luân nhiệt sau: 1. 950C x 15 phút x 1 chu kỳ 2. 940C 580C 720C x 30 giây x 1 phút 30 giây x 1 phút 40 giây x 26 chu kỳ 3. 720C x 30 phút x 1 chu kỳ 4. 40C x giữ vô hạn
� Sản phẩm PCR sẽ được điện di phân tích trên hệ thống điện di mao quản ABI 3500, với các thành phần hỗn hợp điện di như sau :
� Hi-Di Formamide: 14,5µl � Gene Scan 500 ROX: 0,5µl � Sản phẩm PCR: 1,5µl
� Hỗn hợp này được điện di theo chu trình điện di của phân tích đoạn với: Điện thế bơm mẫu: 2,5V
Thời gian bơm mẫu: 20 giây Điện thế điện di: 15V Thời gian điện di: 30 phút
Dữ liệu sau khi điện di mao quản được xuất dưới dạng tập tin .fsa và được phân tích kết quả trisomy bằng phần mềm GeneMarker 1.85. Tất cả các tiêu chuẩn phân tích, đánh giá được căn cứ theo Hướng dẫn thực hành chẩn đoán lệch bội bằng QF-PCR (2007) của Hiệp hội Di truyền Lâm sàng Vương quốc Anh [49]. Theo đó:
� Chỉ phân tích các marker có tín hiệu từ 50 rfu (relative fluorescent units) đến 6000 rfu. Khơng phân tích các marker có tín hiệu < 50 rfu hoặc > 6000 rfu.
� Các marker DHT có 2 alen được phân tích bằng cách tính tỉ số diện tích tín hiệu (peak area) (tín hiệu 1 của alen ngắn / tín hiệu 2 của alen dài).
� Kết luận về số lượng NST phụ thuộc vào tỉ số và sự chênh lệch về độ dài giữa các alen trong một marker như bảng 2.4. Nếu khoảng cách giữa 2 alen < 24 bp thì áp dụng tiêu chuẩn 1, nếu � 24 bp thì áp dụng tiêu chuẩn 2 (bảng 2.4).
Bảng 2.4. Đánh giá tỉ số giữa các alen trong cùng một marker
Tỉ số giữa 2 alen
Marker 2 alen 1:2 Không rõ 1:1 Không rõ 2:1
Tiêu chuẩn 1 < 0,65 0,65 – 0,74 0,75 – 1,44 1,45 – 1,80 > 1,80 Tiêu chuẩn 1 < 0,65 0,65 – 0,74 0,75 – 1,54 1,55 – 1,80 > 1,80
Marker 3 alen Không rõ 1:1:1 Không rõ
Tiêu chuẩn 1 < 0,74 0,75 – 1,44 > 1,45 Tiêu chuẩn 1 < 0,74 0,75 – 1,54 > 1,55
� Các marker đồng hợp tử (1 alen) không dùng để đánh giá số lượng NST.
� Một NST được xác định là disomy khi có ít nhất 2 marker của NST đó ở dạng DHT 2 alen với tỉ số định lượng giữa 2 alen là 1:1.
� Một NST được xác định là trisomy khi có ít nhất 2 marker của NST đó ở dạng DHT 3 alen với tỉ số 1:1:1 hoặc 2 alen với tỉ số 2:1 hoặc 1:2.
� Một NST được xác định là monosomy khi tất cả các marker của NST đó chỉ có 1 alen.
� Xác định monosomy X khi tất cả các marker của NST X chỉ có 1 alen; marker amelogenin chỉ có tín hiệu của X, marker của NST Y khơng có tín hiệu, marker 7X có tỉ số 2:1; marker T2 có tỉ số 1:2.
� Các trường hợp không rõ cần lưu ý kiểm tra quy trình thực hiện kỹ thuật và khả năng mẫu xét nghiệm có bất thường như: khảm, ngoại nhiễm DNA, lặp đoạn ngắn của 1 marker.
2.3.8. Kỹ thuật FISH
Khi xét nghiệm bằng kỹ thuật QF-PCR không cho kết quả hoặc kết quả khơng rõ ràng thì tiến hành thêm kỹ thuật FISH.
Nguyên tắc: Sử dụng các đoạn dò được đánh dấu chất phát huỳnh quang bắt cặp chuyên
biệt với một vùng NST đặc hiệu. Dưới kính hiển vi huỳnh quang, các vị trí đoạn dị huỳnh quang gắn với NST sẽ được phát hiện. Dựa vào số lượng tín hiệu màu huỳnh quang để xác định số lượng các NST: tế bào 2n cho 2 tín hiệu, tế bào lệch bội cho ít hơn hoặc nhiều hơn 2 tín hiệu
Hóa chất:
- Trypsin-EDTA 1X (GIBCO) - Dung dịch KCl 0,075M - Dung dịch carnoy
- Sử dụng bộ kit FISH thương mại VYSIS (Mỹ)
Quy trình: (Theo quy trình kỹ thuật FISH được sử dụng thường quy tại Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học – BVTD)
(1) Phân tách các tế bào gai nhau bằng trypsin-EDTA 1X, sử dụng dung dịch KCl 0,075M sốc nhược trương làm phồng tế bào sau đó cố định bằng carnoy.
(2) Nhỏ tế bào lên lam kính.
(3) Tiến hành các bước lai các đoạn dò đặc hiệu cho các NST 13, 18, 21, X và Y với tế bào theo hướng dẫn của bộ kit thương mại của hãng VYSIS: nhúng tiêu bản
vào pepsin ở 37oC trong 15 phút, phủ đoạn dò, đậy lamelle, dán keo, biến tính ở 72oC trong 5 phút sau đó lai qua đêm ở 37oC.
(4) Xử lý mẫu sau lai: gỡ bỏ keo, rửa với SSC, nhỏ antifade, đậy lamelle.
(5) Phân tích kết quả: quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, đếm tín hiệu trong 50 đến 100 nhân tế bào và chụp hình bằng phần mềm Cytovision 3.1.
2.4. Vấn đề về Y đức
Thực hiện nghiên cứu này khơng vi phạm vấn đề y đức vì một số lý do sau: - Nghiên cứu được thực hiện dựa trên sự tự nguyện tham gia, đối tượng được chọn
có quyền từ chối tham gia nghiên cứu bất cứ khi nào. Nếu từ chối tham gia, họ vẫn được hướng dẫn theo dõi và điều trị bình thường như những người khác. - Kết quả QF-PCR trong q trình nghiên cứu khơng phải là cơ sở để quyết định
việc tiếp tục dưỡng thai hay chấm dứt thai kỳ cho các trường hợp tham gia nghiên cứu.
- Thủ thuật STGN qua ngã bụng dưới sự hướng dẫn của siêu âm đã được huấn luyện và áp dụng thành công tại BVTD từ năm 2008.
CHƯƠNG 3
3.1. Đặc điểm của thai phụ và thai
3.1.1. Tuổi mẹ
Số thai phụ < 35 tuổi chiếm 74,6% (153/205) tổng số thai phụ, gần gấp 3 lần so với thai phụ ≥ 35 tuổi (bảng 3.1). Điều này phù hợp với thực tế vì số thai phụ trong độ tuổi sinh sản 20 – 35 tuổi bao giờ cũng mang thai nhiều hơn thai phụ � 35 tuổi.
Bảng 3.1. Tuổi của thai phụ trong nghiên cứu
Tuổi mẹ Số lượng Tỉ lệ (%)
< 35 153 74,6
≥ 35 52 25,4
Tổng 205 100
3.1.2. Đặc điểm thai kỳ
Đặc điểm thai kỳ ở đây là các yếu tố để xác định nguy cơ dị tật của thai được nêu ở mục 1.2 là KMG và các nguy cơ sinh hóa. Nếu KMG ≥ 2,5 mm là dấu hiệu của thai bị HC Down hoặc các nguy cơ sinh hóa trisomy 13 (T13), trisomy 18 (T18) và trisomy 21 (T21) ≥ 1/250 được xem là nguy cơ cao thai bất thường thì cần phải thực hiện xét nghiệm CĐTS cho thai.
* Khoảng mờ gáy
Bảng 3.2. Khoảng mờ gáy của thai trong nghiên cứu
KMG (mm) Số lượng Tỉ lệ (%)
< 2,5 67 32,7
2,5 – 3,4 35 17,1
≥ 3,5 103 50,2
KMG < 2,5mm có 67 trường hợp chiếm 32,7%, KMG từ 2,5 – 3,4mm có 35 trường hợp chiếm 17,1% và KMG ≥ 3,5mm gồm 103 trường hợp chiếm đến 50,2% (bảng 3.2). Gần 2/3 số thai phụ STGN có nguy cơ HC Down (KMG ≥ 2,5mm) trong đó một nữa tổng số thai phụ có KMG ≥ 3,5mm là ngưỡng được tư vấn STGN, điều này phù hợp với mục tiêu tư vấn xét nghiệm gai nhau.
* Nguy cơ trisomy 21
Bảng 3.3. Nguy cơ trisomy 21 trong xét nghiệm double test
Nguy cơ Số lượng Tỉ lệ (%)
≥ 1/50 154 75,1
1/100 – 1/51 34 16,6
1/250 – 1/101 9 4,4
< 1/250 8 3,9
Tổng 205 100
* Nguy cơ trisomy 18
Bảng 3.4. Nguy cơ trisomy 18 trong xét nghiệm double test
Nguy cơ Số lượng Tỉ lệ (%)
≥ 1/50 25 12,2
1/100 – 1/51 16 7,8
1/250 – 1/101 25 12,2
< 1/250 139 67,8
* Nguy cơ trisomy 13
Bảng 3.5. Nguy cơ trisomy 13 trong xét nghiệm double test
Nguy cơ Số lượng Tỉ lệ (%)
≥ 1/50 30 14,6
1/100 – 1/51 16 7,8
1/250 – 1/101 11 5,4
< 1/250 148 72,2
Tổng 205 100
Nguy cơ T21 ≥ 1/50 chiếm 3/4 số thai phụ, điều này phù hợp với mục tiêu chọn mẫu là lựa chọn những thai phụ có nguy cơ rất cao để STGN. 8 trường hợp có nguy cơ thấp < 1/250 nhưng đa số có KMG > 3mm hoặc nguy cơ T13 hay T18 cao, 1 trường hợp do tiền căn con mắc HC Down và 1 trường hợp song thai mà thai kia có nguy sinh hóa và KMG cao cần CĐTS (bảng 3.3). Bảng 3.4 và bảng 3.5 cho thấy nguy cơ cao về T13 và T18 có tỉ lệ thấp là do tỉ lệ trẻ mắc hai HC này thấp hơn, đồng thời những thai phụ có nguy cơ T13 và T18 thấp được STGN đều có nguy cơ T21 hoặc KMG cao.
Như vậy, kết hợp tất cả các yếu tố nguy cơ như tuổi mẹ, KMG và các yếu tố sinh hóa thì các thai phụ được STGN đều có lý do để xét nghiệm trước sinh cho thai và đa số các trường hợp thai có nguy cơ dị tật rất cao.
3.2. Kết quả tối ưu hóa kỹ thuật QF-PCR
3.2.1. Nồng độ DNA thích hợp
Sau khi khảo sát một số nồng độ DNA, nồng độ trong khoảng 2 – 5ng cho kết quả phân tích tốt nhất. Nồng độ DNA < 2ng: khơng có tín hiệu huỳnh quang hoặc tín hiệu rất thấp (< 100 rfu). Nồng độ DNA > 5ng: tín hiệu huỳnh quang quá cao (> 6000
a
b
c