Kí hiệu marker
Locus
Độ dị hợp tử (%)
Czech Hàn Quốc + Iran Singapore
21A D21S1435 0,78 0,74 - 21B D21S11 0,90 0,78 0,83 21C D21S1411 0,91 0,84 0,87 21D D21S1444 - 0,85 - 18A D18S391 0,64 0,64 0,88 18B D18S978 0,70 0,79 - 18C D18S535 0,78 0,74 0,80 18D D18S386 0,96 0,93 0,87 18M GATA178F11 - 0,81 - 13A D13S742 0,89 0,84 0,85 13B D13S634 0,84 0,74 0,84 13C D13S628 0,78 0,64 0,70 13D D13S305 0,81 0,84 - 21E D21S2039 - - -
21F D21S1412 0,91 - 0,87 21G D21S1446 - - - 18G D18S1002 0,79 - - 18J D18S976 - 0,75 - 13E D13S800 - - - 13F D13S252 - 0,72 - 13G D13S325 - 0,82 - X1 DXS1187 - - - X2 DXS981 0,83 - - X3 XHPRT 0,77 0,68 0,69 XY2 DXYS267 0,82 - -
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VẬT LIỆU
2.1. Thiết bị
Bao gồm một số dụng cụ và thiết bị cơ bản: - Tube vơ trùng các loại 200µl, 500µl và 1,5ml
- Pipette: 0,5 – 10µl, 2 – 20µl, 10 – 100µl, 100 – 1000µl (Eppendorf) và đầu tip tương ứng
- Bình cấy 25 cm2 (NUNC) - Ống Falcon vô trùng 15ml (BD) - Lam kính
- Máy vortex
- Máy ly tâm (Eppendorf) - Bể ủ nhiệt (Memmert)
- Tủ âm sâu -30oC, tủ mát 4 – 8oC
- Máy định lượng DNA Biophotometer Plus (Eppendorf) - Máy luân nhiệt Mastercycler (Eppendorf)
- Hệ thống điện di mao quản ABI 3500/ABI 3130 (Applied Biosystems) - Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 (Heraeus)
- Tủ ấm CO2 Heracell 150 (Heraeus)
- Kính hiển vi Eclipse 80i (Nikon); Hệ thống phân tích NST Metapher và Ikaros (MetaSystems)
Máy ly tâm Máy ủ nhiệt khơ có lắc
Máy định lượng DNA Máy luân nhiệt
Tủ ủ CO2 Micropipette
2.2. Phương pháp thực hiện
Nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ 2.1.
Sơ đồ 2.1. Quy trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QF-PCR
Kỹ thuật karyotype trong nghiên cứu này được tiến hành song song với kỹ thuật QF-PCR để khảo sát các giá trị của kỹ thuật QF-PCR và phát hiện các bất thường cấu trúc NST nếu có.
2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu sinh học
Mẫu gai nhau từ các thai phụ có nguy cơ rất cao bị rối loạn NST được tư vấn và đồng ý tham gia sinh thiết tại BVTD từ 08/2011 đến 11/2011.
* Các chỉ định sinh thiết gai nhau
Trong quy trình tư vấn trước sinh tại BVTD, các thai phụ có nguy cơ sinh hóa ≥ 1/250 hoặc KMG ≥ 2,5mm sẽ được tư vấn chọc hút dịch ối để xét nghiệm cho thai. Tuy nhiên, do STGN có một số hạn chế so với dịch ối đã nêu ở mục 1.5.4 nên chỉ những thai phụ có một trong các nguy cơ sau mới được tư vấn cho chọc gai nhau:
- Nguy cơ sinh hóa ≥ 1/50 - Khoảng mờ gáy ≥ 3,5mm
Mẫu gai nhau sau khi lấy được cho vào ống Falcon 15ml chứa 4ml dung dịch NaCl 0,9% có herparin chống đơng và chuyển ngay về Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học để tiến hành nghiên cứu.
2.3.2. Xử lý gai nhau sau sinh thiết
Nguyên tắc:
- Rửa sạch gai nhau, loại bỏ máu mẹ và các thành phần không phải là gai nhau. - Phân tách sợi gai nhau thành các tế bào bằng cách sử dụng collagenase II.
Hóa chất:
- Dung dịch NaCl 0,9% (Công ty cổ phần dược phẩm 3/2) - Collagenase II (GIBCO)
Quy trình: (Tài liệu nội bộ của Bệnh viện Karolinska, Stockholm, Thụy Điển do Giáo sư Bùi Thế Hùng cung cấp)
- Gai nhau sau sinh thiết được rửa sạch máu mẹ bằng dung dịch NaCl 0,9%. Các sợi gai nhau đạt yêu cầu là các sợi phân nhánh, màu trắng, mịn và ở giữa có mạch máu được chọn giữ lại, các mẫu khơng có hình dạng xác định bị loại bỏ. Mẫu đạt tiêu chuẩn xét nghiệm khi có ít nhất 4 sợi gai nhau đạt yêu cầu ở các vị trí khác nhau của bánh nhau.
- Mẫu đạt thì chuyển qua làm xét nghiệm, mẫu khơng đạt ghi nhận lại và loại bỏ. - Ủ gai nhau trong hỗn hợp bao gồm 1,5ml RPMI + 0,5ml collagenase II 1400uI
qua đêm ở 37oC trong điều kiện 5% CO2.
- Sau khi ủ, hút bỏ dịch nổi, cho vào 1ml môi trường nuôi cấy Amniomax, trộn đều nhẹ nhàng bằng pipette. Mẫu gai nhau lúc này sẵn sàng cho cấy dài ngày hoặc ly trích DNA.
2.3.3. Ni cấy tế bào gai nhau
Nguyên tắc: Nuôi tế bào gai nhau trong mơi trường thích hợp nhằm tăng sinh số lượng
tế bào và thu được tế bào ở giai đoạn kỳ giữa cho quá trình thực hiện bộ NST thai.
Hóa chất:
- AmnioMax C100 Basal Medium (GIBCO) - AmnioMax Supplement (GIBCO)
- Fetal bovine serum (FBS) (GIBCO) - Antibiotic – Antimycotic (GIBCO)
Môi trường nuôi cấy được pha theo tỉ lệ thể tích: 90ml AmnioMax C100, 15ml AmnioMax Supplement, 20ml FBS và 1ml Antibiotic – Antimycotic.
Quy trình: (Theo quy trình ni cấy ối thường quy tại Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học – BVTD)
- Chuẩn bị 2 bình cấy cho mỗi mẫu gai nhau, cho vào 4ml môi trường nuôi cấy. - Cho vào mỗi bình cấy 0,3ml gai nhau, phần gai nhau cịn lại dùng cho ly trích
DNA. Chuyển vào tủ cấy ở điều kiện 37oC và 5% CO2.
- Quan sát tế bào sau một tuần bằng kính hiển vi đảo ngược (độ phóng đại x40). Khi tế bào phát triển và bám dính thành từng cụm vào đáy bình cấy thì thay mơi trường mới.
- Theo dõi sự phát triển của tế bào gai nhau bằng kính hiển vi đảo ngược sau 2 – 3 ngày và tiếp tục thay môi trường. Tùy theo sự phát triển của tế bào, có thể thay môi trường từ 2 – 3 lần.
- Khi mật độ tế bào đủ cho thu hoạch, tiến hành thu hoạch tế bào gai nhau.
2.3.4. Thu hoạch và nhuộm băng nhiễm sắc thể
Nguyên tắc:
Thu hoạch và cố định tế bào gai nhau ở giai đoạn metaphase, cố định tế bào trên lam kính và nhuộm GTG.
Cơng thức pha hóa chất và quy trình nhuộm được thực hiện theo quy trình thường quy tại Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học – BVTD dành cho tế bào máu ngoại vi và dịch ối.
Hóa chất:
- Demecolcine (10µg/ml) (Sigma) - Trypsin-EDTA 1X (GIBCO)
- Dung dịch NaCl 0,9% (Công ty cổ phần dược phẩm 3/2) - KCl 0,075M (0,56g KCl trong 100ml nước cất)
- Dung dịch cố định carnoy (methanol : acetic acid = 3 : 1), pha trước khi sử dụng 1 giờ và giữ lạnh ở 4oC
- Dung dịch PBS 10X (40g NaCl, 1g KCl, 4,6g Na2HPO4, 1g KH2PO4 trong 500ml nước cất)
- Dung dịch trypsin 10X (350 mg trypsin trong 70ml PBS)
- Dung dịch đệm pH 6,8 (9g KH2PO4, 11g Na2HPO4 trong 1000ml nước cất) - Dung dịch thuốc nhuộm Giemsa (MERCK)
Quy trình:
*Thu hoạch tế bào
- Cho vào mỗi bình cấy 0,1ml demecolcine (10μg/ml), lắc đều, ủ ở 37oC trong 1 giờ. Sau đó, đổ bỏ mơi trường, tráng bình cấy bằng dung dịch NaCl 0,9%.
- Cho vào bình cấy 2ml trypsin-EDTA 1X, lắc đều, ủ 10 phút ở 37oC để làm bong tế bào.
- Thu dịch tế bào vào ống Falcon 15ml, tráng bình cấy bằng dung dịch NaCl 0,9%. Ly tâm 1500 vòng/10 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Sốc nhược trương tế bào bằng 6ml dung dịch KCl 0,075M, ủ 10 phút ở 37oC. - Thêm 2ml dung dịch cố định carnoy, vortex đều sau đó đem ly tâm.
- Hút bỏ dịch nổi, thêm vào 6ml dung dịch carnoy, ủ 4oC trong 20 phút. Ly tâm 1500 vòng/10 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Tiếp tục xử lý với 6ml dung dịch carnoy thêm 2 lần nữa. - Ủ lạnh 4oC đến khi nhỏ lên lam kính.
*Nhuộm tiêu bản
- Nhỏ tế bào lên lam kính và sấy ở 90o C trong 30 phút.
- Trước khi nhuộm, trypsin 1X được pha theo thể tích 5ml trypsin 10X : 45ml PBS. Trong quá trình nhuộm, giữ lọ trypsin 1X ở bể ủ 37oC.
- Nhúng tiêu bản vào dung dịch trypsin 1X trong khoảng 8 – 15 giây tùy theo nhiệt độ, độ ẩm và tuổi của tiêu bản, rửa lại bằng dung dịch PBS 1X.
- Để khơ tự nhiên, sau đó nhuộm tiêu bản với thuốc nhuộm Giemsa 10% (1ml Giemsa + 9ml dung dịch đệm pH 6,8) trong 5 – 7 phút.
*Khảo sát và lập bộ karyotype
Các tiêu bản NST được đánh giá theo tiêu chuẩn của hội nghị quốc tế về di truyền người ISCN 2009 (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature) [63]. Các cụm NST đủ tiêu chuẩn phân tích là những cụm có NST phân tán tốt, khơng chồng lấp lên nhau, kích thước NST khơng q ngắn, băng rõ. Các cụm NST được phân tích về số lượng và cấu trúc, đánh giá NST bình thường hay đột biến. Mỗi mẫu được phân tích 30 cụm NST ở kỳ giữa và lập karyotype của ít nhất 3 cụm. Những trường hợp khảm, phân tích 100 cụm NST.
2.3.5. Ly trích DNA từ gai nhau
DNA được ly trích từ gai nhau bằng phương pháp cột lọc, sử dụng kit QIAamp DNA Blood Mini theo hướng dẫn của nhà sản xuất [59].
Tồn bộ quy trình được thực hiện tại một khu vực riêng biệt lập, tuân thủ quy trình chống nhầm lẫn, chống ngoại nhiễm DNA [66]. DNA sau tách chiết được giữ ở 4oC nếu thực hiện xét nghiệm ngay hoặc ở -30oC nếu lưu trữ lâu dài.
2.3.6. Lựa chọn nồng độ DNA thích hợp
DNA sau khi ly trích sẽ được đánh giá độ tinh sạch và định lượng nồng độ bằng máy đo quang phổ Biophotometer Plus (Eppendorf) ở bước sóng 260/280nm. DNA đạt yêu cầu khi có tỉ lệ 1,8 – 2,0. Các mẫu DNA đạt yêu cầu sẽ tiếp tục được thực hiện PCR, các mẫu khơng đạt bị loại bỏ và tiến hành ly trích DNA lại.
Để chuẩn hóa một nồng độ đồng nhất giữa các mẫu bệnh và để cho kết quả phân tích tốt nhất chúng tôi đã tiến hành khảo sát các nồng độ DNA rồi chọn nồng độ thích hợp nhất cho phản ứng khuếch đại.
2.3.7. Muliplex PCR khuếch đại các STR đặc trưng cho NST 13, 18, 21 và X, Y
Nguyên tắc: Các locus STR đa hình đặc hiệu cho các NST đích 13, 18, 21, X và Y được
khuếch đại bằng các đoạn mồi có đánh dấu huỳnh quang. Bằng cách phân tích tỉ lệ màu huỳnh quang đặc trưng cho từng NST sau PCR ta xác định được số lượng NST.
Hình 2.2. Nguyên tắc QF-PCR [73]
Hóa chất: Sử dụng bộ kit chẩn đốn Devyser Complete và Devyser Resolution do hãng
Devyser cung cấp cho kỹ thuật QF-PCR. Bộ kit được chứng nhận bởi CE và được áp dụng tại nhiều phịng xét nghiệm chẩn đốn trên thế giới.
Trường hợp 2 alen
Trường hợp 3 alen
Mồi gắn huỳnh quang Đoạn lặp lại
Quy trình QF-PCR được thực hiện theo sơ đồ 2.2.
Sơ đồ 2.2. Quy trình kỹ thuật QF-PCR * Thành phần kit Devyser Complete:
- PCR Activator
- Devyser Complete Mix 1 - Devyser Complete Mix 2
Mỗi mẫu sẽ được chạy 2 phản ứng PCR đa mồi riêng biệt trong bộ Devyser Complete: phản ứng 1 gồm 13 marker và phản ứng 2 có 15 marker. Các marker được trình bày trong bảng 2.1 và 2.2 [25].