Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. Các kỹ thuật chẩn đoán rối loạn nhiễm sắc thể
1.4.1. Kỹ thuật karyotype
Ni cấy tế bào và phân tích karyotype (nhiễm sắc thể đồ) là phương pháp truyền thống được xem như một tiêu chuẩn vàng trong phân tích rối loạn NST ở người. Ứng dụng kỹ thuật này vào CĐTS bắt đầu được nghiên cứu và thực hiện vào năm 1966 khi Steele và Breg báo cáo về nuôi cấy tế bào ối để xác định bộ NST của thai [56], [65]. Tế bào ối, máu cuống rốn hoặc gai nhau được đem nuôi cấy từ 3 – 14 ngày, sau đó sẽ dừng chu kỳ tế bào ở kỳ giữa dưới tác động của colchicine. Tiến hành thu hoạch tế bào và trải tế bào lên lam kính, nhuộm GTG (Giemsa trypsin G-banding) rồi phân tích bộ NST bằng phần mềm chuyên dụng. Kỹ thuật này có thể xác định bất thường về số lượng lẫn cấu trúc các NST với độ chính xác lên đến 99,4 – 99,8% và rất đáng tin cậy [15], [18].
Tuy nhiên karyotype có nhiều bất lợi là thời gian trả kết quả dài từ 14 – 21 ngày. Điều này vừa tạo ra tâm lý bất an kéo dài đối với thai phụ và khiến cho việc chấm dứt thai kỳ nếu được khuyến cáo trở nên phức tạp và nguy hiểm hơn. Ngoài ra, karyotype cần kỹ thuật viên có hiểu biết và thành thạo về kỹ thuật nuôi cấy tế bào cũng như nhuộm băng NST, cần phải tiến hành việc nuôi cấy tế bào ngay sau khi làm thủ thuật để đảm bảo sự phát triển của tế bào và lượng tế bào phải đủ lớn cho nuôi cấy. Một nhược điểm nữa của karyotype là các bất thường NST trong phạm vi nhỏ hơn 5 – 10 Mb không thể phát hiện được do độ phân giải kém [56].
1.4.2. Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang
Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) là sự kết hợp giữa di truyền phân tử và di truyền tế bào được nghiên cứu áp dụng vào chẩn đoán trước sinh đầu những năm 1990. Nguyên tắc kỹ thuật sử dụng các đoạn dò phân tử được đánh dấu chất phát huỳnh quang bắt cặp chuyên biệt với một vùng NST đặc hiệu. Dưới kính hiển vi huỳnh quang, các vị trí đoạn dị huỳnh quang gắn với NST sẽ được phát hiện. Dựa vào số lượng tín
hiệu màu huỳnh quang để xác định số lượng các NST: tế bào 2n cho 2 tín hiệu, tế bào lệch bội cho ít hơn hoặc nhiều hơn 2 tín hiệu [39], [46].
Vì khơng cần ni cấy nên kỹ thuật FISH cho kết quả xét nghiệm nhanh chỉ trong vòng 2 – 3 ngày. Tuy nhiên giá thành hóa chất xét nghiệm khá cao nên kỹ thuật này khó được áp dụng tại một nước đang phát triển như Việt Nam. Ngoài ra, FISH tốn nhiều công thao tác nên chỉ thực hiện được số lượng mẫu nhất định trong một lần xét nghiệm. Vấn đề phân tích mẫu trong phịng tối thời gian dài cũng ảnh hưởng đến tinh thần của người làm xét nghiệm [33], [46].
1.4.3. Kỹ thuật MLPA
MLPA được ứng dụng để chẩn đoán lệch bội các NST 13, 18, 21 và NST giới tính vào năm 2002. Kỹ thuật này có ưu điểm là có kết quả từ 2 – 4 ngày, chỉ cần 2ml dịch ối và cần ít nhân lực thích hợp cho việc chẩn đốn một số lượng lớn bệnh phẩm.
Nguyên tắc: Đối với mỗi gen mục tiêu, 2 đoạn dò được thiết kế để lai với đoạn liền. Đoạn dò chứa một trình tự đích đặc hiệu ngắn và một đoạn gắn mồi. Một trong những đoạn dò chứa một trình tự đệm. Đối với mỗi đoạn dị cho phản ứng multiplex, phần đệm có một trình tự dài đặc hiệu. Sau khi lai qua đêm với đoạn DNA mục tiêu, mỗi cặp đoạn dò liền kề được nối lại nhờ phản ứng nối. Sau đó PCR được thiết lập với cặp mồi có gắn huỳnh quang, đảm bảo rằng mỗi sản phẩm PCR tỉ lệ thuận với DNA mục tiêu ban đầu. Sản phẩm PCR sau đó được phân tách bằng hệ thống điện di mao quản [16], [23].
MLPA có ưu điểm là xác định trên 40 locus khác nhau trong một phản ứng duy nhất. So sánh với FISH và karyotype, MLPA có thể chẩn đốn với số lượng lớn hơn và giá thành rẻ hơn. Nhược điểm của kỹ thuật này là không thể phát hiện được các trường hợp tam bội và không phát hiện được ngoại nhiễm DNA mẹ [33].
1.4.4. Kỹ thuật CGH
CGH (Comparative Genomic Hybridization) cho phép phân tích tồn thể bộ NST với kết quả chính xác hơn karyotype. Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên mạch đơn DNA lai đặc hiệu với nhau. Trong kỹ thuật CGH, các DNA bộ gen mẫu và DNA bộ gen chứng được đánh dấu bởi các màu huỳnh quang khác nhau, ví dụ màu xanh và màu đỏ, sau đó trộn lẫn chúng và tiến hành lai với NST ở kỳ giữa rồi phân tích tỉ lệ màu huỳnh quang. Kết quả xét nghiệm cho màu vàng (kết hợp của đỏ và xanh) khi số lượng DNA bằng nhau ở mẫu chứng và mẫu bệnh, nếu có 3 NST thì DNA đặc hiệu của NST đó sẽ chuyển sang màu đỏ. Kỹ thuật này có thể phát hiện sự mất cân bằng NST trong chẩn đốn trước sinh. Tuy nhiên hạn chế của nó là phải đảm bảo NST ở giai đoạn metaphase và độ phân giải đạt được chỉ là 3 Mb [44].
1.4.5. Kỹ thuật Array CGH
Kỹ thuật array CGH có thể phát hiện bất thường toàn bộ bộ gen với thời gian nhanh chóng hiện đang được nghiên cứu để đưa vào ứng dụng tại nhiều nước trên thế giới. Array CGH cũng như kỹ thuật CGH truyền thống kỹ thuật này sử dụng các trình tự DNA thay vì NST ở giai đoạn metaphase làm mục tiêu lai. Array CGH có thể phát hiện được lệch bội NST, các vi mất đoạn và các vi lặp đoạn. Array CGH có nhiều thuận lợi trong chẩn đốn trước sinh, là kỹ thuật có độ nhạy và hiệu quả cao, có thể tự động hóa do đó giảm nhân cơng và thời gian thực hiện xét nghiệm cũng như giá thành. Mặc dù array CGH có nhiều ưu điểm trong chẩn đốn trước sinh nhưng khả năng ứng dụng của kỹ thuật này còn nhiều hạn chế do cần một hệ thống máy móc trang thiết bị đắt tiền. Ngồi ra kỹ thuật này cịn cho phép phát hiện những biến đổi rất nhỏ bao gồm cả những biến đổi không ảnh hưởng xấu đến sự biểu hiện kiểu hình, điều này làm cho việc tư vấn kết quả trở nên phức tạp và gây hoang mang cho bệnh nhân[44], [45].
1.4.6. Kỹ thuật QF-PCR
Nhu cầu thiết thực hiện nay là cần một phương pháp chẩn đốn đơn giản, có thể tự động hóa giúp mang lại kết quả chính xác, nhanh chóng và giá thành rẻ. QF-PCR được xem là phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả hiện nay, được nhiều nơi trên thế giới ứng dụng trong phát hiện các lệch bội NST phổ biến 13, 18, 21 và NST giới tính [22], [33], [56], [57].
1.4.6.1. Nguyên tắc
QF-PCR sử dụng các cặp mồi gắn huỳnh quang để khuếch đại các chuỗi DNA có trình tự lặp lại ngắn (STR – Short Tandem Repeat) đặc hiệu cho các NST và có tính đa hình cao. Sản phẩm PCR sau đó được định lượng trên hệ thống điện di mao quản để xác định số lượng NST. Các trường hợp dị hợp tử (DHT) bình thường, sản phẩm STR đặc hiệu NST khi phân tách đoạn sẽ cho 2 đỉnh huỳnh quang với tỉ số giữa 2 đỉnh là 1:1. Ở các trường hợp trisomy, 3 NST sẽ biểu hiện 3 đỉnh huỳnh quang với tỉ số là 1:1:1 (trisomy 3 alen) hoặc chỉ có 2 đỉnh với tỉ số là 2:1 (trisomy 2 alen). Nếu đồng hợp tử, sản phẩm sẽ cho 1 đỉnh huỳnh quang duy nhất và khơng có ý nghĩa chẩn đoán [22], [25].
Kết quả khảo sát được biểu thị như hình 1.3.
1.4.6.2. Khái niệm về STR
STR là các trình tự lặp lại ngắn có kích thước dưới 1000 bp với các trình tự lõi từ 2 đến 6 nucleotide. Số lần lặp lại khác nhau giữa các cá thể nên STR có tính đa hình rất cao. Trên các NST khác nhau chứa các trình tự đa hình STR khác nhau và đặc hiệu cho từng loại NST.
Một locus STR được sử dụng cho phương pháp QF-PCR phải thỏa mãn một số yêu cầu nhất định nên khơng phải đoạn lặp nào cũng có thể sử dụng được. Locus STR phải có tính đa hình và mức độ DHT cao vì một marker trong bộ kit chẩn đốn với nhiều alen đồng hợp tử thì khơng có ý nghĩa chẩn đốn. Ngồi ra, các STR sử dụng làm marker phải có độ dài trung bình từ 100 – 400 bp so với các đoạn đa hình ngẫu nhiên khác. Các đoạn DNA ngắn có độ bền vững cao, ít bị đứt gãy do tác động của điều kiện bên ngoài nên phản ứng PCR thực hiện sẽ hiệu quả hơn. Do đó, STR chứa trình tự lặp lại gồm 2 – 4 nucleotide thường được sử dụng trong các bộ kit QF-PCR [49].
1.4.6.3. Ưu điểm của phương pháp QF-PCR
Kỹ thuật QF-PCR có thể sử dụng mẫu khảo sát với khối lượng mẫu rất nhỏ, khoảng 0,5 – 1ml dịch ối hoặc 3 – 5 sợi gai nhau. Phương pháp PCR khuếch đại DNA trong nhân tế bào nên khơng nhất thiết đó phải là tế bào sống và đang hoạt động nên khơng địi hỏi phải xử lý ngay sau khi lấy mẫu [48]. Ngồi ra, do các locus STR có tính chất là DNA marker đặc hiệu cho từng cá thể nên kỹ thuật QF-PCR cịn có khả năng phát hiện các trường hợp mẫu khảo sát của thai bị ngoại nhiễm DNA của mẹ [21],[45],[56]. Một ưu điểm lớn của kỹ thuật này là có thể tự động hóa nhiều mẫu cùng một lúc, giảm nhân cơng lao động và q trình phân tích kết quả nhanh trong vịng 30 phút nên chỉ trong vòng 24 – 36 giờ làm việc có thể trả kết quả cho bệnh nhân và giá thành xét nghiệm thấp hơn so với các kỹ thuật khác như FISH, MLPA hay array CGH [15], [22], [56].