Chương 3 KẾT QUẢ BIỆN LUẬN
3.2. Kết quả tối ưu hóa kỹ thuật QF-PCR
3.2.1. Nồng độ DNA thích hợp
Sau khi khảo sát một số nồng độ DNA, nồng độ trong khoảng 2 – 5ng cho kết quả phân tích tốt nhất. Nồng độ DNA < 2ng: khơng có tín hiệu huỳnh quang hoặc tín hiệu rất thấp (< 100 rfu). Nồng độ DNA > 5ng: tín hiệu huỳnh quang quá cao (> 6000
a
b
c
Hình 3.1. Kết quả QF-PCR với 3 nồng độ DNA khác nhau
Hình 3.1 cho thấy cùng một mẫu C325, khi PCR với nồng độ DNA cao, sản phẩm PCR sau khi điện di mao quản cho tín hiệu huỳnh quang > 6000 rfu, các marker 21A, 21B và 21D có các alen với tỉ lệ không rõ nên không thể kết luận được là bình thường hay bất thường (hình 3.1a). Ngược lại khi PCR với nồng độ DNA thấp thì tất cả các tín hiệu huỳnh quang lại quá thấp < 100 rfu khơng thể phân tích được (hình 3.1b). Tín hiệu huỳnh quang rõ đẹp khi nồng độ DNA trong khoảng 2 – 5ng, tỉ lệ alen ở các
marker 21A, 21B và 21D thể hiện rõ là 2:1, lúc này có thể kết luận mẫu C325 là trisomy 21 (hình 3.1c).
Do đó, nồng độ DNA trong khoảng 2 – 5 ng được chọn để thực hiện QF-PCR.
3.2.2. Quy trình điện di mao quản
� Nếu điện di sản phẩm PCR trên máy điện di mao quản ABI 3130 theo chu trình hướng dẫn của Devyser: điện thế bơm mẫu 2,5 kV; thời gian bơm mẫu: 20 giây, thì tín hiệu sẽ rất cao (> 6000 rfu), sóng bị chẻ đơi. Kết quả điện di cải thiện rất tốt khi thông số điện di được điều chỉnh thành: điện thế bơm mẫu: 2,3 kV; thời gian bơm mẫu: 14 giây, đảm bảo các sóng có độ cao từ 100 – 6000 rfu, có giá trị cho thơng tin theo đúng Hướng dẫn thực hành chẩn đoán lệch bội bằng QF-PCR (2007) của Hội Di truyền Lâm sàng Vương quốc Anh.
� Vì máy điện di mao quản ABI 3500 là máy thế hệ mới, nên chưa có hướng dẫn chu trình điện di sản phẩm PCR. Chúng tôi đã thiết lập được chu trình điện di mao quản trên máy này dựa trên cơ sở của điện di phân tích đoạn nhưng với điện thế bơm mẫu tăng lên 2,7 kV và thời gian bơm mẫu là 23 giây.