Chương 2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
2.3.4.Thu hoạch và nhuộm băng nhiễm sắc thể
2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.3.4.Thu hoạch và nhuộm băng nhiễm sắc thể
Nguyên tắc:
Thu hoạch và cố định tế bào gai nhau ở giai đoạn metaphase, cố định tế bào trên lam kính và nhuộm GTG.
Cơng thức pha hóa chất và quy trình nhuộm được thực hiện theo quy trình thường quy tại Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học – BVTD dành cho tế bào máu ngoại vi và dịch ối.
Hóa chất:
- Demecolcine (10µg/ml) (Sigma) - Trypsin-EDTA 1X (GIBCO)
- Dung dịch NaCl 0,9% (Công ty cổ phần dược phẩm 3/2) - KCl 0,075M (0,56g KCl trong 100ml nước cất)
- Dung dịch cố định carnoy (methanol : acetic acid = 3 : 1), pha trước khi sử dụng 1 giờ và giữ lạnh ở 4oC
- Dung dịch PBS 10X (40g NaCl, 1g KCl, 4,6g Na2HPO4, 1g KH2PO4 trong 500ml nước cất)
- Dung dịch trypsin 10X (350 mg trypsin trong 70ml PBS)
- Dung dịch đệm pH 6,8 (9g KH2PO4, 11g Na2HPO4 trong 1000ml nước cất) - Dung dịch thuốc nhuộm Giemsa (MERCK)
Quy trình:
*Thu hoạch tế bào
- Cho vào mỗi bình cấy 0,1ml demecolcine (10μg/ml), lắc đều, ủ ở 37oC trong 1 giờ. Sau đó, đổ bỏ mơi trường, tráng bình cấy bằng dung dịch NaCl 0,9%.
- Cho vào bình cấy 2ml trypsin-EDTA 1X, lắc đều, ủ 10 phút ở 37oC để làm bong tế bào.
- Thu dịch tế bào vào ống Falcon 15ml, tráng bình cấy bằng dung dịch NaCl 0,9%. Ly tâm 1500 vòng/10 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Sốc nhược trương tế bào bằng 6ml dung dịch KCl 0,075M, ủ 10 phút ở 37oC. - Thêm 2ml dung dịch cố định carnoy, vortex đều sau đó đem ly tâm.
- Hút bỏ dịch nổi, thêm vào 6ml dung dịch carnoy, ủ 4oC trong 20 phút. Ly tâm 1500 vòng/10 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Tiếp tục xử lý với 6ml dung dịch carnoy thêm 2 lần nữa. - Ủ lạnh 4oC đến khi nhỏ lên lam kính.
*Nhuộm tiêu bản
- Nhỏ tế bào lên lam kính và sấy ở 90o C trong 30 phút.
- Trước khi nhuộm, trypsin 1X được pha theo thể tích 5ml trypsin 10X : 45ml PBS. Trong quá trình nhuộm, giữ lọ trypsin 1X ở bể ủ 37oC.
- Nhúng tiêu bản vào dung dịch trypsin 1X trong khoảng 8 – 15 giây tùy theo nhiệt độ, độ ẩm và tuổi của tiêu bản, rửa lại bằng dung dịch PBS 1X.
- Để khơ tự nhiên, sau đó nhuộm tiêu bản với thuốc nhuộm Giemsa 10% (1ml Giemsa + 9ml dung dịch đệm pH 6,8) trong 5 – 7 phút.
*Khảo sát và lập bộ karyotype
Các tiêu bản NST được đánh giá theo tiêu chuẩn của hội nghị quốc tế về di truyền người ISCN 2009 (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature) [63]. Các cụm NST đủ tiêu chuẩn phân tích là những cụm có NST phân tán tốt, khơng chồng lấp lên nhau, kích thước NST khơng q ngắn, băng rõ. Các cụm NST được phân tích về số lượng và cấu trúc, đánh giá NST bình thường hay đột biến. Mỗi mẫu được phân tích 30 cụm NST ở kỳ giữa và lập karyotype của ít nhất 3 cụm. Những trường hợp khảm, phân tích 100 cụm NST.