Marker Vị trí trên NST Kích thước (bp) Màu huỳnh quang
21H (D21S1442) 21q21.3 360 – 415 Xanh lá 21I (D21S1437) 21q22.2 105 – 150 Vàng 18I (D18S858) 18q21.31 360 – 415 Vàng X4 (DXS6809) Xq21.33 290 – 340 Xanh lam X5 (DXS6854) Xq26.1 392 – 430 Xanh lá X6 (DXS8377) Xq28 430 – 500 Xanh lam X8 (DXS6803) Xq21.31 100 – 140 Xanh lam Y2 (DYS448) Yq11.223 346 – 380 Xanh lam
T2 Xq23
2p23.2
X=114 2=118
Vàng
Hình 2.3. Vị trí các marker trên các NST khảo sát
Để xác định NST giới tính, khảo sát locus SRY của NST Y và locus Amelogenin hiện diện với kích thước khác nhau ở NST X và NST Y. Tuy nhiên, sẽ có một số trường hợp đồng hợp tử các alen trên NST X dẫn đến không thể kết luận được. Lúc này kit Devyser cịn có thêm những marker có sự kết hợp giữa NST giới tính X và NST thường như 7X, T2 để xác định rõ giới tính. Ví dụ marker 7X thể hiện mối tương quan giữa NST số 7 và NST X. Khi thai mang 2 NST giới tính X marker này sẽ thể hiện tỉ lệ đỉnh alen là 1:1, khi thai mang 1 NST X trong trường hợp giới tính nam hay HC Turner XO thì tỉ lệ đỉnh alen là 2:1 (hình 2.4). Đây chính là một trong những ưu điểm của kit Devyser [25].
A B Hình 2.4. Marker 7X [25]
A: Tỉ lệ alen 1:1, B: Tỉ lệ alen 2:1
Quy trình:
� Tổng thể tích của các hỗn hợp phản ứng PCR đều là 25µl, bao gồm: � Hỗn hợp PCR: 20µl
� Các phản ứng PCR được chạy theo chu trình luân nhiệt sau: 1. 950C x 15 phút x 1 chu kỳ 2. 940C 580C 720C x 30 giây x 1 phút 30 giây x 1 phút 40 giây x 26 chu kỳ 3. 720C x 30 phút x 1 chu kỳ 4. 40C x giữ vô hạn
� Sản phẩm PCR sẽ được điện di phân tích trên hệ thống điện di mao quản ABI 3500, với các thành phần hỗn hợp điện di như sau :
� Hi-Di Formamide: 14,5µl � Gene Scan 500 ROX: 0,5µl � Sản phẩm PCR: 1,5µl
� Hỗn hợp này được điện di theo chu trình điện di của phân tích đoạn với: Điện thế bơm mẫu: 2,5V
Thời gian bơm mẫu: 20 giây Điện thế điện di: 15V Thời gian điện di: 30 phút
Dữ liệu sau khi điện di mao quản được xuất dưới dạng tập tin .fsa và được phân tích kết quả trisomy bằng phần mềm GeneMarker 1.85. Tất cả các tiêu chuẩn phân tích, đánh giá được căn cứ theo Hướng dẫn thực hành chẩn đoán lệch bội bằng QF-PCR (2007) của Hiệp hội Di truyền Lâm sàng Vương quốc Anh [49]. Theo đó:
� Chỉ phân tích các marker có tín hiệu từ 50 rfu (relative fluorescent units) đến 6000 rfu. Khơng phân tích các marker có tín hiệu < 50 rfu hoặc > 6000 rfu.
� Các marker DHT có 2 alen được phân tích bằng cách tính tỉ số diện tích tín hiệu (peak area) (tín hiệu 1 của alen ngắn / tín hiệu 2 của alen dài).
� Kết luận về số lượng NST phụ thuộc vào tỉ số và sự chênh lệch về độ dài giữa các alen trong một marker như bảng 2.4. Nếu khoảng cách giữa 2 alen < 24 bp thì áp dụng tiêu chuẩn 1, nếu � 24 bp thì áp dụng tiêu chuẩn 2 (bảng 2.4).