Hình 3.1 cho thấy cùng một mẫu C325, khi PCR với nồng độ DNA cao, sản phẩm PCR sau khi điện di mao quản cho tín hiệu huỳnh quang > 6000 rfu, các marker 21A, 21B và 21D có các alen với tỉ lệ không rõ nên không thể kết luận được là bình thường hay bất thường (hình 3.1a). Ngược lại khi PCR với nồng độ DNA thấp thì tất cả các tín hiệu huỳnh quang lại q thấp < 100 rfu khơng thể phân tích được (hình 3.1b). Tín hiệu huỳnh quang rõ đẹp khi nồng độ DNA trong khoảng 2 – 5ng, tỉ lệ alen ở các
marker 21A, 21B và 21D thể hiện rõ là 2:1, lúc này có thể kết luận mẫu C325 là trisomy 21 (hình 3.1c).
Do đó, nồng độ DNA trong khoảng 2 – 5 ng được chọn để thực hiện QF-PCR.
3.2.2. Quy trình điện di mao quản
� Nếu điện di sản phẩm PCR trên máy điện di mao quản ABI 3130 theo chu trình hướng dẫn của Devyser: điện thế bơm mẫu 2,5 kV; thời gian bơm mẫu: 20 giây, thì tín hiệu sẽ rất cao (> 6000 rfu), sóng bị chẻ đơi. Kết quả điện di cải thiện rất tốt khi thông số điện di được điều chỉnh thành: điện thế bơm mẫu: 2,3 kV; thời gian bơm mẫu: 14 giây, đảm bảo các sóng có độ cao từ 100 – 6000 rfu, có giá trị cho thông tin theo đúng Hướng dẫn thực hành chẩn đoán lệch bội bằng QF-PCR (2007) của Hội Di truyền Lâm sàng Vương quốc Anh.
� Vì máy điện di mao quản ABI 3500 là máy thế hệ mới, nên chưa có hướng dẫn chu trình điện di sản phẩm PCR. Chúng tôi đã thiết lập được chu trình điện di mao quản trên máy này dựa trên cơ sở của điện di phân tích đoạn nhưng với điện thế bơm mẫu tăng lên 2,7 kV và thời gian bơm mẫu là 23 giây.
3.3. Kết quả chẩn đốn bằng kỹ thuật QF-PCR
Tồn bộ 205 DNA gai nhau được thực hiện 2 phản ứng PCR của kit Devyser Complete, kết quả có 17 mẫu khơng kết luận được do có dưới 2 marker cho thơng tin trên một NST. 17 mẫu này được phân tích lần hai bằng kit Devyser Resolution với nhiều marker hơn đối với NST chưa kết luận được. Sau cùng, kết quả chẩn đoán bằng QF- PCR được trình bày theo bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật QF-PCR Kết quả Số lượng Tỉ lệ (%) Kết quả Số lượng Tỉ lệ (%) Bình thường XX, bình thường 57 27,80 XY, bình thường 111 54,15 Trisomy 21, XX 6 2,93 Bất thường Trisomy 21, XY 9 4,39 Trisomy 21, XXY 1 0,49 Trisomy 18, XX 3 1,46 Trisomy 18, XY 4 1,95 Trisomy 13, XX 3 1,46 XO 5 2,44 XO/XX 2 0,98 Nhiễm DNA mẹ 4 1,95 Tổng 205 100
Kết quả chẩn đoán lệch bội NST từ mẫu gai nhau bằng phương pháp QF-PCR: - 168 trường hợp bình thường chiếm 81,95%
- 31 trường hợp lệch bội NST 13, 18, 21 và NST giới tính X, Y chiếm 15,12%
- 2 trường hợp bất thường khảm (0,98%) và 4 trường hợp nhiễm DNA mẹ (1,95%) không kết luận được phải kiểm tra lại bằng chọc hút dịch ối lúc thai 18 tuần
Như vậy phương pháp QF-PCR trong nghiên cứu có thể chẩn đốn chính xác 97,1% (199/205) các lệch bội NST 13, 18, 21 và NST giới tính X, Y. Trong tổng số 201 mẫu gai nhau (loại trừ 4 ca nhiễm DNA mẹ), chỉ có 17 trường hợp cần phải kiểm tra lại kết quả với nhiều marker hơn bằng kit Devyser Resolution. Kit Devyser Complete đã chẩn đoán được 91,5% (184/201) các trường hợp, tỉ lệ lớn mẫu kết luận được kết quả chỉ bằng kit Devyser Complete giúp tiết kiệm được thời gian và chi phí xét nghiệm.
Về thời gian xét nghiệm, ngoài những trường hợp thể khảm và nhiễm DNA mẹ, kỹ thuật QF-PCR cho kết quả chỉ sau 24 – 36 giờ nhận mẫu trong khi thời gian có kết quả của NST đồ lên đến 14 – 21 ngày. Do đó, nếu QF-PCR được ứng dụng vào CĐTS sẽ giảm được áp lực, mệt mỏi cho thai phụ và gia đình vì chờ kết quả.
*Một số kết quả phân tích QF-PCR:
a b