Nhu cầu thiết thực hiện nay là cần một phương pháp chẩn đoán đơn giản, có thể tự động hóa giúp mang lại kết quả chính xác, nhanh chóng và giá thành rẻ. QF-PCR được xem là phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả hiện nay, được nhiều nơi trên thế giới ứng dụng trong phát hiện các lệch bội NST phổ biến 13, 18, 21 và NST giới tính [22], [33], [56], [57].
1.4.6.1. Nguyên tắc
QF-PCR sử dụng các cặp mồi gắn huỳnh quang để khuếch đại các chuỗi DNA có trình tự lặp lại ngắn (STR – Short Tandem Repeat) đặc hiệu cho các NST và có tính đa hình cao. Sản phẩm PCR sau đó được định lượng trên hệ thống điện di mao quản để xác định số lượng NST. Các trường hợp dị hợp tử (DHT) bình thường, sản phẩm STR đặc hiệu NST khi phân tách đoạn sẽ cho 2 đỉnh huỳnh quang với tỉ số giữa 2 đỉnh là 1:1. Ở các trường hợp trisomy, 3 NST sẽ biểu hiện 3 đỉnh huỳnh quang với tỉ số là 1:1:1 (trisomy 3 alen) hoặc chỉ có 2 đỉnh với tỉ số là 2:1 (trisomy 2 alen). Nếu đồng hợp tử, sản phẩm sẽ cho 1 đỉnh huỳnh quang duy nhất và không có ý nghĩa chẩn đoán [22], [25].
Kết quả khảo sát được biểu thị như hình 1.3.
1.4.6.2. Khái niệm về STR
STR là các trình tự lặp lại ngắn có kích thước dưới 1000 bp với các trình tự lõi từ 2 đến 6 nucleotide. Số lần lặp lại khác nhau giữa các cá thể nên STR có tính đa hình rất cao. Trên các NST khác nhau chứa các trình tự đa hình STR khác nhau và đặc hiệu cho từng loại NST.
Một locus STR được sử dụng cho phương pháp QF-PCR phải thỏa mãn một số yêu cầu nhất định nên không phải đoạn lặp nào cũng có thể sử dụng được. Locus STR phải có tính đa hình và mức độ DHT cao vì một marker trong bộ kit chẩn đoán với nhiều alen đồng hợp tử thì không có ý nghĩa chẩn đoán. Ngoài ra, các STR sử dụng làm marker phải có độ dài trung bình từ 100 – 400 bp so với các đoạn đa hình ngẫu nhiên khác. Các đoạn DNA ngắn có độ bền vững cao, ít bị đứt gãy do tác động của điều kiện bên ngoài nên phản ứng PCR thực hiện sẽ hiệu quả hơn. Do đó, STR chứa trình tự lặp lại gồm 2 – 4 nucleotide thường được sử dụng trong các bộ kit QF-PCR [49].
1.4.6.3. Ưu điểm của phương pháp QF-PCR
Kỹ thuật QF-PCR có thể sử dụng mẫu khảo sát với khối lượng mẫu rất nhỏ, khoảng 0,5 – 1ml dịch ối hoặc 3 – 5 sợi gai nhau. Phương pháp PCR khuếch đại DNA trong nhân tế bào nên không nhất thiết đó phải là tế bào sống và đang hoạt động nên không đòi hỏi phải xử lý ngay sau khi lấy mẫu [48]. Ngoài ra, do các locus STR có tính chất là DNA marker đặc hiệu cho từng cá thể nên kỹ thuật QF-PCR còn có khả năng phát hiện các trường hợp mẫu khảo sát của thai bị ngoại nhiễm DNA của mẹ [21],[45],[56]. Một ưu điểm lớn của kỹ thuật này là có thể tự động hóa nhiều mẫu cùng một lúc, giảm nhân công lao động và quá trình phân tích kết quả nhanh trong vòng 30 phút nên chỉ trong vòng 24 – 36 giờ làm việc có thể trả kết quả cho bệnh nhân và giá thành xét nghiệm thấp hơn so với các kỹ thuật khác như FISH, MLPA hay array CGH [15], [22], [56].