3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.3.NỘI DUNG 3: XÂY DỰNG MÔ HÌNH CHUỘT UNG THƯ VÚ DỊ
GHÉP
3.3.1. Hiệu quả gây suy giảm miễn dịch trên chuột nhắt trắng
Chuột bình thường có lượng bạch cầu tổng 7.000-10.000 tế bào/mm3
máu. Chuột cái đã xử lý với Busulfan và Cyclophosphamide có thể trạng giảm sút, không tăng cân, lông xù, di chuyển kém linh hoạt, lượng bạch cầu tổng giảm tối thiểu 50%, một số con bị mù, sụt cân nặng, rất yếu và thậm chí tử vong. Tỷ lệ tử vong sau khi xử lý thuốc 1-3 ngày là 13%. Chuột có lượng bạch cầu tổng thấp hơn 1000 tế
bào/mm3 rất dễ tử vong trong suốt quá trình thí nghiệm nên được loại bỏ. Chuột đáp
ứng thuốc yếu nên sau khi xử lý thuốc lượng bạch cầu tổng vẫn khá cao, 2000 –
4000 tế bào/mm3, còn khả năng gây đáp ứng thải loại khác loài mạnh với tế bào ung
thư VNBC-GFP người, khối u không xuất hiện hoặc không duy trì được lâu dài nên cũng bị loại bỏ. Chuột thỏa mãn điều kiện lượng bạch cầu tổng sau khi xử lý thuốc
giảm còn 1000-2000 tế bào/mm3 và còn tương đối khỏe mạnh, mạch máu đuôi còn
nghiệm tác động tế bào tua. Trước khi ghép tế bào VNBC-GFP, chuột đã gây suy giảm miễn dịch được nuôi ổn định và theo dõi thêm 2 ngày.
3.3.2. Nuôi cấy dòng tế bào VNBC-GFP
Tế bào VNBC-GFP được nuôi cấy trong môi trường DMEM F12 10%FBS có
khả năng tăng sinh nhanh, sau khi cấy chuyền 2-4 ngày tế bào đã phát triển phủ hết 90% bề mặt nuôi cấy. Tế bào có dạng đặc trưng của tế bào ung thư vú biểu mô.
Hình 3. 17. Hình thái tế bào VNBC-GFP
Tế bào này biểu hiện mạnh và ổn định gen GFP. Sau nhiều lần cấy chuyền tế bào vẫn giữ nguyên đặc tính phát huỳnh quang khi kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Hình 3. 18. Tế bào VNBC-GFP phát huỳnh quang (x400)
(a) Hình chụp bình thường; (b) Hình chụp phát huỳnh quang
Dòng tế bào VNBC-GFP ổn định lâu dài phù hợp tạo mô hình chuột ung thư vú bằng phương pháp dị ghép khác loài.
A
B
3.3.3. Hiệu quả tạo mô hình chuột mang khối u vú người
3.3.3.1. Hình thái bên ngoài
Chuột suy giảm miễn dịch đã được ghép tế bào VNBC-GFP bằng cách tiêm
5x105 tế bào/con vào vùng mỡ vú, sau 1-2 ngày có thể nhận thấy sự xuất hiện tại vị
trí ghép khối u rắn, trắng đục, cứng ăn sâu vào mô mỡ bên trong. Khối u này sau đó tiếp tục nổi rõ, kích thước tăng dần. Một số trường hợp không thấy rõ khối u vào giai đoạn 1-4 ngày đầu do khối u nhỏ và ăn sâu vào mô mỡ dưới da, khó nhận biết bằng mắt thường. Sau đó, khối u phát triển, to hơn và bắt đầu nổi rõ, quan sát bằng mắt thường được. Một số chuột có hiện diện khối u nhưng sau đó khối u nhỏ dần rồi biến mất hoặc khối u có miệng và hình thành ổ viêm. Vì vậy, sau khi chuột xuất hiện khối u, tiếp tục nuôi ổn định và theo dõi thêm năm ngày để chọn được chuột có khối u rõ, ổn định, dễ đo kích thước và quan sát bằng mắt thường phục vụ cho thử
nghiệm tác động của tế bào tua. Hiệu quả tạo mô hình dựa trên sự xuất hiện khối u
trắng đục, cứng tại vị trí tiêm tế bào VNBC-GFP ổn định năm ngày. Như vậy, hiệu quả tạo mô hình đạt cao lên đến 87%. Về thể trạng các con chuột này cũng có thể trạng kém, lông xù, kém linh hoạt và sụt cân nhẹ.
Hình 3. 19. Khối u xuất hiện tại vùng mỡ vú chuột (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(a) Khối u nổi rõ tại vùng mỡ vú; (b) Khối u màu trắng hiện rõ trong nội quan chuột
3.3.3.2. Khả năng phát huỳnh quang của khối u chuột
Chuột được ghép tế bào VNBC-GFP xuất hiện khối u trắng đục tại vị trí tiêm tế bào (vùng mỡ vú). Khối u này được kiểm tra bằng kĩ thuật quét chuột phát hiện phát huỳnh quang chuyên biệt cho protein GFP. 100% chuột xuất hiện khối u nhìn rõ
A
B
bằng mắt thường khi được gây mê đưa vào máy scan chuột đều có hiện tượng phát huỳnh quang ngay tại khối u chứng tỏ trong khối u có các tế bào biểu hiện GFP ở mức độ protein. Các tế bào phát huỳnh quang này chính là tế bào ung thư vú VNBC-GFP được tiêm vào chuột, đã phát triển thành khối u.
Hình 3. 20. Chuột mang khối u phát huỳnh quang
3.3.3.3. Mô học khối u chuột
a. Nhuộm H&E
Mẫu khối u trên chuột được thu nhận và cắt lát mô Paraffin, nhuộm H&E để kiểm tra hình thái tế bào có trong mẫu. Trong khối u chuột xuất hiện ổ tế bào ác tính, có nhiều mạch máu xâm nhập (tế bào hồng cầu hiện diện trong lòng mạch) nuôi tế bào ung thư, ít tế bào mỡ. Trong mẫu mô vú bình thường cùng vị trí tiêm tế bào VNBC-GFP không có dạng tế bào ác tính, hầu như không có mạch máu xâm nhập, nhiều tế bào mỡ, tế bào tương đối đồng nhất.
A
Hình 3. 21. Hình thái tế bào trong mô khối u cắt lát được nhuộm H&E
(a, b) Mô vú bình thường; (c) Mô khối u chuột có ổ tế bào ác tính; (d)Tế bào ác tính và mạch máu xâm nhập trong khối u chuột
b. Sự tồn tại tế bào phát huỳnh quang trên mẫu lát cắt mô ung thư
Khối u trên chuột được cắt lát mô lạnh và kiểm tra sự hiện diện của tế bào phát huỳnh quang bằng cách quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Phần lớn tế bào trong lát cắt phát huỳnh quang mạnh chứng tỏ có sự hiện diện của tế bào VNBC- GFP trong khối u.
Hình 3. 22. Lát cắt mô khối u phát huỳnh quang
(a)Ảnh chụp huỳnh quang; (b) Ảnh chụp bình thường
Chuột được tiêm tế bào VNBC-GFP có xuất hiện khối u màu trắng đục, cứng,
trong khi chuột tiêm PBS cùng vị trí không xuất hiện khối u. Khối u này có sự hiện diện của tế bào phát huỳnh quang khi được kiểm tra theo hai phương pháp (quét chuột và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang mẫu cắt lát mô) và có đặc tính của khối ung thư (có tế bào ung thư bất thường, có sự tăng sinh mạch máu) chứng tỏ đây là khối u ung thư do chính các tế bào VNBC-GFP phát triển thành.
D
3.4. NỘI DUNG 4: ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG IN VIVO CỦA TẾ BÀO TUA
ĐÃ CẢM ỨNG KHÁNG NGUYÊN THU TỪ KHỐI U VÀ TẾ BÀO UNG
THƯ VÚ SƠ CẤP
3.4.1. Hình thái bên ngoài
Chuột ở các lô thí nghiệm và đối chứng có hình thái bên ngoài không khác biệt. Từ khi tiêm tế bào VNBC-GFP, chuột không xử lý với thuốc gây suy giảm miễn
dịch, hệ miễn dịch và hệ thống tạo máu bắt đầu hồi phục, thể trạng chuột thay đổi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
theo chiều hướng tốt hơn. Đến ngày thứ bảy sau khi tiêm tế bào tua, tất cả chuột đều khỏe mạnh, thể trọng trở lại tương đương với lúc trước khi xử lý thuốc, lông mượt và di chuyển linh hoạt hơn.
Chuột thuộc lô đối chứng trắng (tiêm PBS) và lô đối chứng (tiêm tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên) có khối u vẫn phát triển, ngày càng nổi rõ tại vùng vú, hầu hết khi phẫu thuật vẫn là một khối rắn. Ngược lại, chuột thuộc lô thí nghiệm
(tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp) có
khối u ngày càng nhỏ dần, một số khối u gần như không thấy rõ, nhiều khối u có dấu hiệu viêm sưng đỏ, khối u có miệng, khi phẫu thuật một số có hiện tượng chảy dịch trắng.
Hình 3. 23. Hình thái khối u chuột ngày N7
Khối u trên tất cả chuột trong lô đối chứng và cả lô thí nghiệm đều phát huỳnh quang khi được scan bằng máy iBox. Tuy nhiên, khối u chuột được tiêm tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên có tín hiệu huỳnh quang yếu hơn khối u chuột được tiêm PBS hoặc tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên. Điều này cho phép tiên đoán
lượng tế bào GFP phát huỳnh quang trong khối u chuột tiêm tế bào tua cảm ứng
kháng nguyên ít hơn khối u chuột đối chứng. Đồng thời chứng tỏ tế bào tua được
cảm ứng kháng nguyên khi tiêm vào chuột mô hình ung thư vú có vai trò diệt bớt tế bào phát huỳnh quang trong khối u.
Hình 3. 24. Khối u phát huỳnh quang ngày N7
3.4.2. Sự biến động bạch cầu tổng
Ngay trước thời điểm tiêm tế bào tua, tất cả chuột mô hình ung thư vú được
kiểm tra bạch cầu tổng. Lượng bạch cầu tổng dao động 700-3700 tế bào/mm3
, trong đó phần lớn chuột có lượng bạch cầu tổng trong khoảng 1000-2000 tế bào/ mm3
(chiếm 43%) và 2000-3000 tế bào/mm3 (chiếm 46%), chỉ có 11% chuột có lượng bạch cầu tổng dưới 1000 tế bào/mm3
. Điều này cho thấy sau khi ghép tế bào VNBC-GFP năm ngày hệ miễn dịch chuột bắt đầu hồi phục, có thể có lợi cho khả năng đáp ứng miễn dịch chống khối u nhờ tế bào tua cảm ứng kháng nguyên.
Hình 3. 25. Biểu đồ sự biến động bạch cầu tổng trước và sau khi tiêm tế bào tua trong lô thí nghiệm và lô đối
Kết quả thực nghiệm cho thấy sau khi tiêm tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên, lượng bạch cầu tổng ngoại vi tăng lên đáng kể, gấp bốn lần so với trước khi tiêm. Giữa hai lô thí nghiệm tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ khối u và từ tế bào ung thư sơ cấp không có sự khác biệt về biến động bạch cầu tổng trước và sau khi tiêm bảy ngày (lô kháng nguyên tế bào tăng 4,4 lần so với lô kháng nguyên khối u tăng 4,7 lần, p > 0,05). Ngược lại, ở lô đối chứng tuy cũng có hiện tượng bạch cầu tổng tăng lên nhưng mức tăng không đáng kể, chỉ đạt 1,7 lần ở lô tiêm PBS và 1,9 lần ở lô tiêm tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên, thấp hơn rõ rệt so với các lô
tiêm tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên (p < 0,05). Chuột được tiêm tế bào tua
không cảm ứng kháng nguyên không có sự thay đổi bạch cầu tổng đáng kể so với
Hình 3. 26. Biểu đồ biến động bạch cầu tổng giữa các lô thí nghiệm tiêm tế bào tua cảm
ứng kháng nguyên từ tế bào ung thư sơ cấp và khối u
Điều này chứng tỏ, tế bào tua đã được trưởng thành in vitro nhưng không được cho trình diện kháng nguyên ung thư, khi đưa vào cơ thể chuột không có khả năng kích hoạt hệ miễn dịch của chuột đủ để tiêu diệt khối u. Bản thân khối u có những cơ chế riêng để chống lại khả năng trình diện kháng nguyên ung thư của tế bào tua
cho các tế bào T để tránh khỏi bị tiêu diệt. Vì vậy, tế bào tua có sẵn trong cơ thể
chuột hay tế bào tua ngoại lai đưa vào chuột không kích hoạt được bạch cầu chống khối u nên lượng bạch cầu tổng không thay đổi đáng kể. Sự thay đổi bạch cầu tổng này có thể do sự hồi phục từ từ của chuột sau một thời gian dài không bị ức chế miễn dịch bởi Busulfan và Cyclophosphamide.
3.4.3. Sự thay đổi kích thước khối u (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuột được tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên đều có hiện tượng giảm kích thước khối u từ từ (đến ngày N7 phần lớn các lô giảm hơn 30%). Giữa các lô thí
nghiệm tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào ung thư vú sơ
cấp của ba mẫu ung thư khác nhau, sự thay đổi kích thước khối u tương đương nhau (p > 0,05). Trong mỗi lô thí nghiệm này, kích thước khối u chuột giảm không đáng
kể giữa ngày N4 và N7 (p > 0,05; trừ lô tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ tế bào ung thư vú sơ cấp của mẫu số 39, p < 0,05). Điều này cho thấy việc tiêm tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên có hiệu quả ngăn cản sự phát triển và tiêu diệt từ từ khối u. Kháng nguyên thu từ khối u và từ tế bào ung thư vú sơ cấp có hiệu quả như nhau trong khả năng làm giảm kích thước khối u.
Hình 3. 27. Biểu đồ thay đổi kích thước khối u trong chuột được tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào sơ cấp
Chuột được tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên giảm kích thước khối u so
với chuột được tiêm PBS và tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên. So với thời điểm trước khi tiêm tế bào tua, ngày N0, từ ngày N4 chuột được tiêm PBS và tiêm tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên tăng kích thước khối u rõ rệt (lô PBS tăng 73%, lô tế bào tua tăng 48%); ngược lại, chuột được tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp giảm kích thước (lô khối u giảm 18%, lô tế bào giảm 16%). Ngày N4 đến ngày N7, chuột được tiêm PBS tăng kích thước khối u rõ rệt (p < 0,05); chuột được tiêm tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên
tuy có xu hướng tăng kích thước khối u nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa (p >
0,05); chuột được tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên có xu hướng giảm kích thước khối u nhưng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Ngày N4, khối u của
chuột được tiêm PBS tăng cao hơn hẳn khối u chuột được tiêm tế bào tua cảm ứng
kháng nguyên (p < 0,05). Khối u chuột được tiêm tế bào tua không cảm ứng kháng
nguyên tuy tăng kích thước nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa so với khối u chuột thí nghiệm và chuột đối chứng trắng (p > 0,05). Ngày N7, chuột trong lô đối chứng đều tăng kích thước khối u và mức tăng của lô tiêm PBS cao hơn lô tiêm tế bào tua (p < 0,05). Ngược lại, lô thí nghiệm tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên đều giảm kích thước khối u và khác biệt hoàn toàn với lô đối chứng (p < 0,05).
Hình 3. 28. Biểu đồ thay đổi kích thước khối u trong lô đối chứng và thí nghiệm
Nhìn chung, việc tiêm tế bào tua có cảm ứng kháng nguyên có hiệu quả giảm
kích thước khối u chuột so với chỉ tiêm PBS hoặc tiêm tế bào tua không cảm ứng
kháng nguyên. Hiệu quả giảm kích thước khối u của tế bào tua cảm ứng kháng
nguyên từ khối u vú tương đương với tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ tế bào
ung thư vú sơ cấp. Việc tiêm tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên tuy vẫn làm khối u tăng kích thước nhưng cũng có hiệu quả giúp ổn định sự tăng trưởng của khối u và giảm mức tăng trưởng này so với chuột chỉ được tiêm PBS.
3.4.4. Sự thay đổi tỷ lệ tế bào VNBC-GFP trong khối u
Lượng tế bào VNBC-GFP là tế bào phát huỳnh quang trong khối u chuột ngày N7 ở các lô thí nghiệm đều rất thấp (chỉ có 0,17-5,48% tế bào phát huỳnh quang
trong tổng số tế bào thu từ khối u chuột). Không nhận thấy sự khác biệt có ý nghĩa
về tỷ lệ tế bào VNBC-GFP trong các lô tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ
khối u vú và tế bào ung thư vú sơ cấp của ba mẫu khối u bệnh nhân (p > 0,05).
Hình 3. 29. Biểu đồ tỷ lệ % tế bào VNBC-GFP trong khối u của các lô chuột tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào sơ cấp
Hình 3. 30. Biểu đồ tỷ lệ % tế bào VNBC-GFP trong khối u chuột của các lô đối chứng và thí nghiệm
Tế bào VNBC-GFP ở lô đối chứng trắng chiếm tỷ lệ cao nhất, cao hơn lô tiêm tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên và lô tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên (lô đối chứng trắng, lô tế bào tua, lô tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ khối u vú và tế bào ung thư vú sơ cấp ngưới lần lượt có tỷ lệ là 15,91%; 9,37%; 2,81% và 1,45% với p < 0,05). Việc tiêm tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên cũng có hiệu quả làm giảm lượng tế bào VNBC-GFP gây ung thư trên chuột nhưng hiệu quả vẫn thấp hơn nhiều so với việc tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên (p < 0,05). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhìn chung, tế bào tua có cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào ung thư vú