a. Thu nhận kháng nguyên từ khối u và tế bào
Mảnh khối u vú cùng mẫu với tế bào ung thư vú sơ cấp. Mảnh khối u được cắt nhuyễn bằng kéo.
Tế bào ung thư vú nuôi cấy sơ cấp được thu nhận bằng cách tách khỏi bề mặt nuôi cấy nhờ Trypsin/EDTA 0,25%, xác định mật độ tế bào bằng cách nhuộm tế bào với Trypan blue, cho mẫu vào buồng đếm hồng cầu và xác định lượng tế bào sống bằng kính hiển vi điện tử.
Dịch khối u cắt nhuyễn và dịch huyền phù tế bào được bổ sung thêm protease inhibitor 1%. Dịch phân mảnh protein khối u và tế bào được thu nhận bằng cách đông lạnh giải đông nhanh 5 lần (cho eppendoft chứa dịch đã xử lý với protease vào nitrogen lỏng -1960C trong 2 phút, lấy ra ngoài để trong bể ổn nhiệt 370C trong 5 phút, lập lại quy trình 5 lần).
Ly tâm 2000 vòng/phút trong 5 phút thu nhận cặn protein.
Định lượng protein bằng phương pháp Bradford.
Trộn 10µl dịch protein nói trên với 250µl tác nhân Bradford. Tạo dung dịch protein chuẩn pha với tác nhân Bradford với các nồng độ 10µg/ml, 62,5µg/ml, 250µg/ml, 500µg/ml và 1000µg/ml để xây dựng đồ thị nồng độ protein chuẩn theo mật độ quang. Mẫu được phân tích bằng máy Multimode Reader (Beckman
coulter). Từ kết quả mật độ quang của protein từ khối u hoặc tế bào ung thư vú sơ cấp xác định hàm lượng protein của mỗi loại. Thông thường, mẫu khối u cho kết quả hàm lượng protein cao hơn mẫu tế bào ung thư vú sơ cấp nên cần điều chỉnh hàm lượng protein thích hợp, tương thích giữa hai mẫu để cảm ứng với tế bào tua.
b. Cảm ứng kháng nguyên vào tế bào tua
Protein khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp được thu nhận và cho vào môi trường CM2 nuôi tế bào tua ở ngày thứ 12 theo tỷ lệ 40µg/ml.
Cho tế bào tua đã biệt hóa cảm ứng với dịch protein thu từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp trong 2 ngày.
Ngày 14, thu tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp.
Quy trình thực hiện
Loại bỏ môi trường CM2, rửa tế bào 2 lần bằng dung dịch PBS.
Tách tế bào bằng Trypsin/EDTA 0,25% trong 15-30 phút (vì tế bào tua bám rất chặt trên bề mặt bình nuôi nên thời gian tách có thể gấp 2-5 lần bình thường và phải gõ bề mặt bình nuôi thường xuyên trong suốt quá trình ủ với Trypsin).
Thu dịch huyền phù tế bào, thêm 5ml dung dịch PBS và ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút; thu cặn tế bào và tái huyền phù trong 1 ml dung dịch PBS.
Xác định mật độ tế bào bằng thuốc nhuộm Trypan blue và buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi điện tửởđộ phóng đại 200-400 lần.
Cốđịnh lượng tế bào tua tiêm vào chuột với nồng độ 105 tế bào/50µl.