2.2.4.1. Tạo mô hình chuột suy giảm miễn dịch
Busulfan và Cyclophosphamide đều là những tác nhân alkyl hóa có khả năng gắn chèn nhóm alkyl vào base guanine của DNA đang phân chia nhưng cơ chế tự sửa sai không thể nhận diện và sửa chữa. DNA bị tổn thương dẫn đến tế bào nhanh chóng đi vào cơ chế chết theo chương trình. Do đó Busulfan và Cyclophosphamide chỉ tấn công những tế bào có khả năng phân chia mạnh như tế bào ung thư, tế bào sinh dục đang tăng sinh và cả các tế bào gốc tạo máu trong tủy xương, các tế bào
đầu dòng lympho, tế bào đầu dòng tủy, mà tạo ra hồng cầu và tất cả tế bào miễn dịch. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh Busulfan và Cyclophosphamide đều có thể gây ức chế miễn dịch mạnh ở liều thích hợp. Busulfan và Cyclophosphamide được ứng dụng trong điều trị ung thư và cả trong các liệu pháp ức chế miễn dịch chống thải ghép hoặc trong điều trị chống bệnh mảnh ghép chống kí chủ sau khi ghép tủy xương. Với chủng chuột Mus Musculus var. Albino liều gây hủy tủy (50mg/kg Busulfan kết hợp với 50mg/kg/ngày x 5 ngày cho Cyclophosphamide) đã được nghiên cứu tại PTN. Tế bào gốc từ năm 2008. Busulfan được chứng minh có độc tính cao hơn Cyclophosphamide và dễ gây chết cho chuột, trong khi Cyclophosphamide có khả năng duy trì ức chế miễn dịch lâu dài nếu xử lý kéo dài với liều thấp mà không gây chết chuột. Vì vậy chúng tôi tạo mô hình chuột suy giảm miễn dịch với liều như sau:
Tiêm Busulfan liều 25mg/kg vào xoang bụng; tiêm Cyclophosphamide liều 50mg/kg/ngày x 4 ngày vào tĩnh mạch đuôi.
Kiểm tra bạch cầu tổng những con chuột đã xử lý với Busulfan và Cyclophosphamide, chọn chuột có lượng bạch cầu tổng 1000-2000 tế bào/mm3 để tạo mô hình chuột mang khối u vú.
2.2.4.2. Nuôi cấy dòng tế bào ung thư vú người Việt Nam chuyển gen GFP
a. Quy trình nuôi cấy tế bào
Dòng tế bào ung thư vú người Việt Nam được chuyển gen GFP bằng lentivirus (gọi là dòng VNBC-GFP) được nuôi tăng sinh trong môi trường DMEM F12 10%FBS ở 370C và 5% CO2.
Tế bào phát triển rất nhanh, sau 4-6 ngày nuôi cấy, tế bào phát triển chiếm 80- 90% bề mặt bình nuôi và có thể cấy chuyền được.
Cấy chuyền trong môi trường có huyết thanh: loại bỏ môi trường cũ, rửa tế bào 2 lần bằng dung dịch PBS, tách tế bào bằng 0,5ml Trypsin/EDTA 0,25% trong 2-5 phút; sau khi tế bào tách khỏi bề mặt nuôi thêm 10ml môi trường DMEM 10% FBS bất hoạt và chuyển vào 3 bình nuôi.
b. Đánh giá tế bào chuyển gen GFP
Kiểm tra khả năng phát huỳnh quang của tế bào VNBC-GFP bằng kính hiển vi huỳnh quang.
2.2.4.3. Tạo mô hình chuột mang khối u vú
Thu tế bào VNBC-GFP bằng cách tách tế bào bằng trypsin/EDTA 0,25%, bất hoạt trypsin, huyền phù dịch tế bào ở mật độ 5x105 tế bào/20µl.
Cạo sạch lông vùng bụng để có thể xác định được 2 cặp vú ở phần thân dưới chuột, sát trùng vùng vú bằng cồn 70o.
Tiêm tế bào với liều 5x105 tế bào/con vào vùng mỡ vú chuột bằng kim tiêm 26G.
Quan sát hằng ngày để phát hiện sự xuất hiện khối u trắng đục, cứng tại vị trí tiêm.
2.2.4.4. Đánh giá hiệu quả tạo mô hình
a. Đánh giá mô học bằng nhuộm H&E mẫu cắt lát mô khối u trên chuột
Sau khi ghép tế bào VNBC-GFP lên chuột đã suy giảm miễn dịch 12 ngày, giết chuột và cắt lấy khối u tại vùng mỡ vú. Cố định mẫu mô trong dung dịch Paraformandehide 4% trong tối đa 1 ngày, chuyển mẫu đến khoa Giải phẫu, Trường Đại học Y-Dược Tp. Hồ Chí Minh để tiến hành cắt lát mô theo phương pháp cắt Paraffin, sau đó nhuộm mẫu với Hematoxylin và Eosin, mẫu cắt lát được chuyển cho bác sĩ chuyên khoa để xác định mô ung thư, sự hoại tử, viêm và sự xâm nhập của tế bào bạch cầu.
b. Đánh giá sự tồn tại của tế bào VNBC-GFP trên lát cắt mô khối u chuột
Sau khi ghép tế bào VNBC-GFP lên chuột đã suy giảm miễn dịch 12 ngày, giết chuột và cắt lấy khối u tại vùng mỡ vú. Cố định mẫu trong dung dịch cốđịnh lạnh và tiến hành cắt lát mô lạnh ngay sau khi thu mẫu. Mẫu cắt lát mô lạnh được cố định trên lame và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang để xác định sự tồn tại của tế bào phát huỳnh quang (là tế bào VNBC-GFP) trong mẫu.
c. Đánh giá sự tồn tại tế bào VNBC-GFP trên khối u chuột
Khối u bắt đầu xuất hiện sau 24 giờ ghép tế bào VNBC-GFP và hiện rõ trong 5 ngày tiếp theo. Chuột có khối u ổn định trong 5 ngày được gây mê bằng Zoletil, cạo sạch lông vùng bụng có khối u. Chuột được đặt ngửa vào khoang của máy scan chuột, mở tia UV và nhanh chóng chụp hình với bước sóng phát huỳnh quang xanh GFP tại vị trí có khối u để kiểm tra khả năng phát huỳnh quang của khối u.
2.2.5. Nội dung 4: Đánh giá tác động in vivo của tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên thu từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp nguyên thu từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp
2.2.5.1. Bố trí thí nghiệm
Chuột mô hình mang khối u vú người có khối u trắng đục, cứng nổi rõ tại vị trí tiêm tế bào VNBC-GFP ổn định trong 5 ngày được dùng cho nội dung nghiên cứu tác động tế bào tua in vivo.
Thực hiện 4 lô thực nghiệm:
- Lô đối chứng trắng (blank): 5 con chuột mô hình ung thư được tiêm dung dịch PBS vào tĩnh mạch đuôi.
- Lô đối chứng (control): 5 con chuột mô hình ung thưđược tiêm tĩnh mạch tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên với liều 1x105 tế bào tua/con.
- Lô thí nghiệm 1 (experiment): 9 con chuột mô hình ung thư được tiêm dịch huyền phù tế bào tua cảm ứng kháng nguyên thu từ 3 mẫu khối u khác nhau với liều 1x105 tế bào tua/con. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lô thí nghiệm 2 (experiment): 9 con chuột mô hình ung thư được tiêm dịch huyền phù tế bào tua cảm ứng kháng nguyên thu từ 3 mẫu tế bào ung thư vú nuôi cấy sơ cấp khác nhau với liều 1x105 tế bào tua/con.
Thời gian tiến hành thí nghiệm được phân bố như sau:
Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm theo thời gian tiến hành
Ngày quy ước Thí nghiệm tiến hành
N-10 Bắt đầu xử lý chuột với Busulfan (liều 25mg/kg tiêm một liều vào ngày N-10) và Cyclophosphamide (liều 50mg/kg/ngày x 4
ngày tiêm liên tục bốn ngày từ N-9 đến N-6).
N-5 Tiêm tế bào VNBC-GFP vào vùng mỡ vú cho chuột đủ tiêu chuẩn (bạch cầu tổng 1000-2000 tế bào/mm3 máu).
N0 Tiêm tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên; tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên và dung dịch PBS cho chuột mô hình ung thư vú. Đo kích thước khối u, xác định bạch cầu tổng trước khi tiêm tế bào.
N4 Đo kích thước khối u
N7 Đo kích thước khối u, xác định bạch cầu tổng. Giết chuột, thu khối u kiểm tra mô học, lượng tế bào GFP phát huỳnh quang.
2.2.5.2. Đánh giá sự thay đổi kích thước khối u
Đo kích thước khối u bằng thước đo vào các thời điểm: trước khi ghép tế bào tua (ngày N0), sau khi ghép tế bào tua 4 ngày (ngày N4) và 7 ngày (ngày N7).
Hình 2. 2. Phương pháp đo kích thước khối u
Đo 2 chiều kích thước (chiều dài và chiều rộng) của khối u bằng thước có độ chia nhỏ nhất là 1mm, làm tròn đến 0,5mm.
Khối u gồm 2 phần, một phần nằm ẩn bên trong khoang bụng và một phần nổi lên bề mặt da (thường có dạng hình bầu dục hoặc hình tròn) tại vùng tiêm tế bào VNBC-GFP. Do đó trên thực tế chỉ xác định được kích thước khối u khi không
phẫu thuật chuột theo hai chiều (chiều dài và chiều rộng). Vì vậy, kích thước khối u được tính theo diện tích với công thức:
Diện tích = dài x rộng (mm2)
2.2.5.3. Đánh giá sự biến động bạch cầu tổng
Số lượng bạch cầu tổng được xác định vào các thời điểm: trước khi ghép tế bào tua (ngày N0), sau khi ghép tế bào tua 7 ngày (ngày N7).
Phương pháp thực hiện - Sát trùng đuôi chuột.
- Dùng kim tiêm 23G thu máu tĩnh mạch đuôi chuột
- Hút máu vào ống trộn bạch cầu đến vạch 0.5, hút tiếp dung dịch ly giải hồng cầu đến vạch 11, lắc trộn đều trong 3 phút.
- Bỏ 3-4 giọt đầu tiên, đặt mẫu máu vào buồng đếm hồng cầu.
- Xác định trên kính hiển viở vật kính x40 và đếm tổng số bạch cầu có nhân, có màng trên 4 vùng đếm 16 ô.
Công thức tính bạch cầu tổng
- Tỉ lệ máu pha loãng là 0,5/11=1/22 (bỏ 2 đơn vị không chứa tế bào bạch cầu).
- Độ dày lớp máu giữa lamelle và buồng đếm là 1/10, diện tích mỗi ô vuông lớn là 1mm2. Vậy thể tích mỗi ô là 1/10mm3. Suy ra số lượng bạch cầu là:
N= A : 4 x 20 : 1/10 = A x 50 (tế bào/mm3 máu)
A: tổng số bạch cầu đếm được trong 4 ô lớn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.5.4. Đánh giá sự khác biệt lượng tế bào gây ung thư
Sau 7 ngày ghép tế bào tua, chuột được giết chết, thu nhận khối u. Khối u được cho vào 1ml Superenzyme – Superextract (hỗn hợp nhiều enzyme bao gồm cả Collagenase và Trypsin), cắt nhuyễn và ủở 370C trong 3 giờ.
Dịch huyền phù tế bào đã xử lý với enzyme được ly tâm và rửa lại hai lần bằng dung dịch PBS, thu cặn tế bào.
Tái huyền phù cặn tế bào với dung dịch FACSFlow và tiến hành chạy Flow Cytometry kiểm tra tỷ lệ tế bào phát huỳnh quang trong quần thể tế bào khối u.
2.2.5.5. Thống kê kết quả
Sử dụng phần mềm Microsoft Excell để thống kê, xử lý và vẽ các đồ thị liên quan đến kết quả.
Sử dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV để xử lý thống kê kết quảở mức tin cậy 95%.
3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. NỘI DUNG 1: NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO UNG THƯ VÚ THU TỪ
KHỐI U
3.1.1. Sự tăng sinh và hình thái tế bào ung thư sơ cấp
Trong nuôi cấy sơ cấp, tế bào bắt đầu phát triển từ rìa mảnh mô sau 5-20 ngày. Khi đó, phần lớn các mảnh mô đã bám chặt vào bề mặt nuôi và giảm tiết chất thải. Tế bào mọc lan ra với nhiều hình thái: tế bào hình bầu dục, hình hạt gạo hoặc hình tam giác, nổi trên bề mặt, nằm rải rác xung quanh mảnh mô.
Hình 3. 1. Tế bào mới phát triển từ rìa mảnh mô
Tế bào tiếp tục tăng sinh và mọc lan rộng ra xung quanh rìa mảnh mô sau 4-7 ngày, tiếp tục lan rộng và chiếm hết bề mặt bình nuôi hoặc mọc chồng lên nhau hình thành những vùng dày đặc tế bào và bắt đầu có hiện tượng tế bào chết dần trong các vùng này.
Mảnh mô ung thư vú bao gồm nhiều loại tế bào, có tế bào ung thư vú biểu mô, tế bào gốc ung thư vú, tế bào ung thư vú dạng trung mô, nguyên bào sợi, tế bào ống tuyến vú, tế bào mô vú bình thường, tế bào gốc vú, tế bào nền, tế bào sản xuất sữa... Quá trình nuôi sơ cấp cần nhiều thời gian, thông thường từ một mảnh mô sau hơn 20 ngày tế bào phát triển phủ khắp bề mặt bình nuôi. Trong quá trình nuôi cấy những tế bào có khả năng tăng sinh như tế bào ung thư, nguyên bào sợi hay tế bào gốc đều có thể phát triển mạnh và chiếm ưu thế. Các tế bào biểu mô vú bình thường, tế bào sản xuất sữa không có khả năng phát triển lâu dài trong môi trường
M171 nên ban đầu có thể xuất hiện dạng tế bào này nhưng về sau sẽ chết đi. Tùy
từng bệnh nhân, giai đoạn bị ung thư và vùng mô ung thư vú được thu nhận mà các tế bào trong các mảnh mô đem đi nuôi cấy có thể khác nhau về số lượng, về thành phần dẫn đến có sự xuất hiện nhiều loại quần thể tế bào với hình thái hoàn toàn khác nhau trong nuôi cấy.
Môi trường M171 không huyết thanh tạo ra áp lực chọn lọc và ưu thế tăng trưởng cho các tế bào ung thư biểu mô vú. Trong phần lớn các mẫu khối u, quần thể
tế bào chiếm ưu thế là quần thể tế bào ung thư có hình thái giống biểu mô. Trong
các nghiên cứu về dòng tế bào ung thư vú người Việt Nam cho thấy, các tế bào ung thư giống biểu mô là các tế bào biểu hiện các marker cho tế bào ung thư vú và có khả năng hình thành khối u trên động vật. Qua nhiều lần cấy chuyền (3-5 lần) và duy trì nuôi trong điều kiện môi trường M171 các quần thể tế bào này sẽ trở nên tương đối đồng nhất về mặt hình thái và đều có dạng biểu mô.
Những quần thể tế bào dạng trung mô hoặc giống nguyên bào sợi có thể là các tế bào nền khối u, nguyên bào sợi hoặc là các tế bào ung thư có khả năng chuyển dạng (chuyển dạng biểu mô thành dạng trung mô và ngược lại). Tế bào nền khối u, nguyên bào sợi sau quá trình nuôi cấy lâu dài dưới áp lực chọn lọc của môi trường M171 sẽ chết dần. Tế bào chuyển dạng trung mô-biểu mô (Epithelial-mesenchymal transition cells) đã được chứng minh là có tính ác tính mạnh, chịu trách nhiệm cho sự di căn của khối u [8]. Quần thể có dạng tế bào này chiếm ưu thế có tỷ lệ tế bào
gốc ung thư vú cao và có thể được sử dụng làm nguồn tạo tế bào gốc ung thư vú
[24]. Dạng biểu mô được duy trì trong môi trường không huyết thanh. Dạng trung mô được duy trì trong môi trường có huyết thanh
Hình 3. 4. Quần thể tế bào nền khối u hoặc tế bào ung thư chuyển dạng trung mô-biểu mô
Sau nhiều ngày nuôi cấy tế bào phát triển dày đặc với các hình thái khác nhau, trong khi một số mẫu lại có tế bào phát triển rải rác. Trong nuôi cấy sơ cấp mảnh mô, tế bào mới mọc từ mảnh mô tiết ra nhiều chất thải, chất nhầy chiếm không gian nuôi cấy làm một số quần thể không thể tăng sinh lan rộng hết toàn bộ bề mặt bình nuôi mà khu trú tại một vùng, các tế bào mọc chồng lên nhau thành nhiều lớp dày đặc. Hiện tượng này gây bất lợi cho nuôi cấy sơ cấp vì các tế bào mọc dày đặc chồng lên nhau sẽ chiếm không gian phát triển của nhau, tế bào lớp dưới hay ở bên trong không tiếp xúc được với chất dinh dưỡng của môi trường nên chết dần. Phương pháp khắc phục là trong suốt quá trình nuôi khi thay môi trường luôn tráng rửa sạch bề mặt nuôi bằng dung dịch PBS để giảm đến mức thấp nhất các chất dơ, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chất nhầy và mô mỡ bám vào bình nuôi. Di chuyển mảnh mô sang bình nuôi mới hoặc lưu trữ lạnh khi tế bào bắt đầu mọc lan rộng ra rìa mảnh mô để đảm bảo không
gian cho các tế bào phát triển. Khi hiện tượng tế bào mọc dày đặc co cụm tại một
vùng nhất định xuất hiện, nếu đã rửa sạch bề mặt nuôi mà tế bào vẫn không tiếp tục mọc lan ra các vùng khác thì tiến hành cấy chuyển sang bình nuôi mới.
Hình 3. 5. Quần thể tế bào phát triển dày đặc (a) và rải rác (b)
Có ba mẫu khối u xuất hiện quần thể tế bào có hình dạng đặc biệt, khác lạ so với các quần thể tế bào khác. Tế bào có dạng sợi rất dài với những nốt tròn nhỏ như khuẩn ti nấm hoặc những sợi dài mảnh nằm sát bề mặt.
Hình 3. 6. Các quần thể tế bào sơ cấp có hình thái đặc biệt
Năm mẫu khối u xuất hiện quần thể tế bào mọc thành từng cụm nhỏ hoặc các khối tròn tối màu giống như hiện tượng tạo khối cầu (sphere). Các quần thể này có thể có sự hiện diện tế bào gốc ung thư vú ở mức cao hơn các dạng quần thể khác.
A
B
Hình 3. 7. Quần thể tế bào sơ cấp phát triển thành dạng khối cầu-sphere
Một số khối u có sự tăng trưởng tế bào nhanh, tế bào mọc dày đặc, hoặc kết