Chuột mô hình mang khối u vú người có khối u trắng đục, cứng nổi rõ tại vị trí tiêm tế bào VNBC-GFP ổn định trong 5 ngày được dùng cho nội dung nghiên cứu tác động tế bào tua in vivo.
Thực hiện 4 lô thực nghiệm:
- Lô đối chứng trắng (blank): 5 con chuột mô hình ung thư được tiêm dung dịch PBS vào tĩnh mạch đuôi.
- Lô đối chứng (control): 5 con chuột mô hình ung thưđược tiêm tĩnh mạch tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên với liều 1x105 tế bào tua/con.
- Lô thí nghiệm 1 (experiment): 9 con chuột mô hình ung thư được tiêm dịch huyền phù tế bào tua cảm ứng kháng nguyên thu từ 3 mẫu khối u khác nhau với liều 1x105 tế bào tua/con.
- Lô thí nghiệm 2 (experiment): 9 con chuột mô hình ung thư được tiêm dịch huyền phù tế bào tua cảm ứng kháng nguyên thu từ 3 mẫu tế bào ung thư vú nuôi cấy sơ cấp khác nhau với liều 1x105 tế bào tua/con.
Thời gian tiến hành thí nghiệm được phân bố như sau:
Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm theo thời gian tiến hành
Ngày quy ước Thí nghiệm tiến hành
N-10 Bắt đầu xử lý chuột với Busulfan (liều 25mg/kg tiêm một liều vào ngày N-10) và Cyclophosphamide (liều 50mg/kg/ngày x 4
ngày tiêm liên tục bốn ngày từ N-9 đến N-6).
N-5 Tiêm tế bào VNBC-GFP vào vùng mỡ vú cho chuột đủ tiêu chuẩn (bạch cầu tổng 1000-2000 tế bào/mm3 máu).
N0 Tiêm tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên; tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên và dung dịch PBS cho chuột mô hình ung thư vú. Đo kích thước khối u, xác định bạch cầu tổng trước khi tiêm tế bào.
N4 Đo kích thước khối u
N7 Đo kích thước khối u, xác định bạch cầu tổng. Giết chuột, thu khối u kiểm tra mô học, lượng tế bào GFP phát huỳnh quang.
2.2.5.2. Đánh giá sự thay đổi kích thước khối u
Đo kích thước khối u bằng thước đo vào các thời điểm: trước khi ghép tế bào tua (ngày N0), sau khi ghép tế bào tua 4 ngày (ngày N4) và 7 ngày (ngày N7).
Hình 2. 2. Phương pháp đo kích thước khối u
Đo 2 chiều kích thước (chiều dài và chiều rộng) của khối u bằng thước có độ chia nhỏ nhất là 1mm, làm tròn đến 0,5mm.
Khối u gồm 2 phần, một phần nằm ẩn bên trong khoang bụng và một phần nổi lên bề mặt da (thường có dạng hình bầu dục hoặc hình tròn) tại vùng tiêm tế bào VNBC-GFP. Do đó trên thực tế chỉ xác định được kích thước khối u khi không
phẫu thuật chuột theo hai chiều (chiều dài và chiều rộng). Vì vậy, kích thước khối u được tính theo diện tích với công thức:
Diện tích = dài x rộng (mm2)
2.2.5.3. Đánh giá sự biến động bạch cầu tổng
Số lượng bạch cầu tổng được xác định vào các thời điểm: trước khi ghép tế bào tua (ngày N0), sau khi ghép tế bào tua 7 ngày (ngày N7).
Phương pháp thực hiện - Sát trùng đuôi chuột.
- Dùng kim tiêm 23G thu máu tĩnh mạch đuôi chuột
- Hút máu vào ống trộn bạch cầu đến vạch 0.5, hút tiếp dung dịch ly giải hồng cầu đến vạch 11, lắc trộn đều trong 3 phút.
- Bỏ 3-4 giọt đầu tiên, đặt mẫu máu vào buồng đếm hồng cầu.
- Xác định trên kính hiển viở vật kính x40 và đếm tổng số bạch cầu có nhân, có màng trên 4 vùng đếm 16 ô.
Công thức tính bạch cầu tổng
- Tỉ lệ máu pha loãng là 0,5/11=1/22 (bỏ 2 đơn vị không chứa tế bào bạch cầu).
- Độ dày lớp máu giữa lamelle và buồng đếm là 1/10, diện tích mỗi ô vuông lớn là 1mm2. Vậy thể tích mỗi ô là 1/10mm3. Suy ra số lượng bạch cầu là:
N= A : 4 x 20 : 1/10 = A x 50 (tế bào/mm3 máu)
A: tổng số bạch cầu đếm được trong 4 ô lớn
2.2.5.4. Đánh giá sự khác biệt lượng tế bào gây ung thư
Sau 7 ngày ghép tế bào tua, chuột được giết chết, thu nhận khối u. Khối u được cho vào 1ml Superenzyme – Superextract (hỗn hợp nhiều enzyme bao gồm cả Collagenase và Trypsin), cắt nhuyễn và ủở 370C trong 3 giờ.
Dịch huyền phù tế bào đã xử lý với enzyme được ly tâm và rửa lại hai lần bằng dung dịch PBS, thu cặn tế bào.
Tái huyền phù cặn tế bào với dung dịch FACSFlow và tiến hành chạy Flow Cytometry kiểm tra tỷ lệ tế bào phát huỳnh quang trong quần thể tế bào khối u.
2.2.5.5. Thống kê kết quả
Sử dụng phần mềm Microsoft Excell để thống kê, xử lý và vẽ các đồ thị liên quan đến kết quả.
Sử dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV để xử lý thống kê kết quảở mức tin cậy 95%.
3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. NỘI DUNG 1: NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO UNG THƯ VÚ THU TỪ
KHỐI U
3.1.1. Sự tăng sinh và hình thái tế bào ung thư sơ cấp
Trong nuôi cấy sơ cấp, tế bào bắt đầu phát triển từ rìa mảnh mô sau 5-20 ngày. Khi đó, phần lớn các mảnh mô đã bám chặt vào bề mặt nuôi và giảm tiết chất thải. Tế bào mọc lan ra với nhiều hình thái: tế bào hình bầu dục, hình hạt gạo hoặc hình tam giác, nổi trên bề mặt, nằm rải rác xung quanh mảnh mô.
Hình 3. 1. Tế bào mới phát triển từ rìa mảnh mô
Tế bào tiếp tục tăng sinh và mọc lan rộng ra xung quanh rìa mảnh mô sau 4-7 ngày, tiếp tục lan rộng và chiếm hết bề mặt bình nuôi hoặc mọc chồng lên nhau hình thành những vùng dày đặc tế bào và bắt đầu có hiện tượng tế bào chết dần trong các vùng này.
Mảnh mô ung thư vú bao gồm nhiều loại tế bào, có tế bào ung thư vú biểu mô, tế bào gốc ung thư vú, tế bào ung thư vú dạng trung mô, nguyên bào sợi, tế bào ống tuyến vú, tế bào mô vú bình thường, tế bào gốc vú, tế bào nền, tế bào sản xuất sữa... Quá trình nuôi sơ cấp cần nhiều thời gian, thông thường từ một mảnh mô sau hơn 20 ngày tế bào phát triển phủ khắp bề mặt bình nuôi. Trong quá trình nuôi cấy những tế bào có khả năng tăng sinh như tế bào ung thư, nguyên bào sợi hay tế bào gốc đều có thể phát triển mạnh và chiếm ưu thế. Các tế bào biểu mô vú bình thường, tế bào sản xuất sữa không có khả năng phát triển lâu dài trong môi trường
M171 nên ban đầu có thể xuất hiện dạng tế bào này nhưng về sau sẽ chết đi. Tùy
từng bệnh nhân, giai đoạn bị ung thư và vùng mô ung thư vú được thu nhận mà các tế bào trong các mảnh mô đem đi nuôi cấy có thể khác nhau về số lượng, về thành phần dẫn đến có sự xuất hiện nhiều loại quần thể tế bào với hình thái hoàn toàn khác nhau trong nuôi cấy.
Môi trường M171 không huyết thanh tạo ra áp lực chọn lọc và ưu thế tăng trưởng cho các tế bào ung thư biểu mô vú. Trong phần lớn các mẫu khối u, quần thể
tế bào chiếm ưu thế là quần thể tế bào ung thư có hình thái giống biểu mô. Trong
các nghiên cứu về dòng tế bào ung thư vú người Việt Nam cho thấy, các tế bào ung thư giống biểu mô là các tế bào biểu hiện các marker cho tế bào ung thư vú và có khả năng hình thành khối u trên động vật. Qua nhiều lần cấy chuyền (3-5 lần) và duy trì nuôi trong điều kiện môi trường M171 các quần thể tế bào này sẽ trở nên tương đối đồng nhất về mặt hình thái và đều có dạng biểu mô.
Những quần thể tế bào dạng trung mô hoặc giống nguyên bào sợi có thể là các tế bào nền khối u, nguyên bào sợi hoặc là các tế bào ung thư có khả năng chuyển dạng (chuyển dạng biểu mô thành dạng trung mô và ngược lại). Tế bào nền khối u, nguyên bào sợi sau quá trình nuôi cấy lâu dài dưới áp lực chọn lọc của môi trường M171 sẽ chết dần. Tế bào chuyển dạng trung mô-biểu mô (Epithelial-mesenchymal transition cells) đã được chứng minh là có tính ác tính mạnh, chịu trách nhiệm cho sự di căn của khối u [8]. Quần thể có dạng tế bào này chiếm ưu thế có tỷ lệ tế bào
gốc ung thư vú cao và có thể được sử dụng làm nguồn tạo tế bào gốc ung thư vú
[24]. Dạng biểu mô được duy trì trong môi trường không huyết thanh. Dạng trung mô được duy trì trong môi trường có huyết thanh
Hình 3. 4. Quần thể tế bào nền khối u hoặc tế bào ung thư chuyển dạng trung mô-biểu mô
Sau nhiều ngày nuôi cấy tế bào phát triển dày đặc với các hình thái khác nhau, trong khi một số mẫu lại có tế bào phát triển rải rác. Trong nuôi cấy sơ cấp mảnh mô, tế bào mới mọc từ mảnh mô tiết ra nhiều chất thải, chất nhầy chiếm không gian nuôi cấy làm một số quần thể không thể tăng sinh lan rộng hết toàn bộ bề mặt bình nuôi mà khu trú tại một vùng, các tế bào mọc chồng lên nhau thành nhiều lớp dày đặc. Hiện tượng này gây bất lợi cho nuôi cấy sơ cấp vì các tế bào mọc dày đặc chồng lên nhau sẽ chiếm không gian phát triển của nhau, tế bào lớp dưới hay ở bên trong không tiếp xúc được với chất dinh dưỡng của môi trường nên chết dần. Phương pháp khắc phục là trong suốt quá trình nuôi khi thay môi trường luôn tráng rửa sạch bề mặt nuôi bằng dung dịch PBS để giảm đến mức thấp nhất các chất dơ,
chất nhầy và mô mỡ bám vào bình nuôi. Di chuyển mảnh mô sang bình nuôi mới hoặc lưu trữ lạnh khi tế bào bắt đầu mọc lan rộng ra rìa mảnh mô để đảm bảo không
gian cho các tế bào phát triển. Khi hiện tượng tế bào mọc dày đặc co cụm tại một
vùng nhất định xuất hiện, nếu đã rửa sạch bề mặt nuôi mà tế bào vẫn không tiếp tục mọc lan ra các vùng khác thì tiến hành cấy chuyển sang bình nuôi mới.
Hình 3. 5. Quần thể tế bào phát triển dày đặc (a) và rải rác (b)
Có ba mẫu khối u xuất hiện quần thể tế bào có hình dạng đặc biệt, khác lạ so với các quần thể tế bào khác. Tế bào có dạng sợi rất dài với những nốt tròn nhỏ như khuẩn ti nấm hoặc những sợi dài mảnh nằm sát bề mặt.
Hình 3. 6. Các quần thể tế bào sơ cấp có hình thái đặc biệt
Năm mẫu khối u xuất hiện quần thể tế bào mọc thành từng cụm nhỏ hoặc các khối tròn tối màu giống như hiện tượng tạo khối cầu (sphere). Các quần thể này có thể có sự hiện diện tế bào gốc ung thư vú ở mức cao hơn các dạng quần thể khác.
A
B
Hình 3. 7. Quần thể tế bào sơ cấp phát triển thành dạng khối cầu-sphere
Một số khối u có sự tăng trưởng tế bào nhanh, tế bào mọc dày đặc, hoặc kết cụm tròn; số khác lại tăng trưởng chậm, tế bào mọc rải rác. Kết quả này có thể do khối u thu nhận có chứa hoặc không chứa “ổ ung thư”. Trong một khối u được cắt thành nhiều mảnh, có hiện tượng một số mảnh có tế bào xuất hiện sớm, tăng sinh mạnh, có mảnh hầu như không có tế bào mọc hoặc tăng sinh yếu. Mảnh khối u vú có “ổ tế bào ung thư” hoặc “ổ tế bào gốc ung thư” tế bào phát triển mạnh, lan khắp bề mặt nuôi, mọc dày đặc xếp chồng lên nhau thậm chí hình thành những cụm tế bào sphere giống như tế bào gốc ung thư vú nuôi trong môi trường tạo sphere. Những mảnh khối u có các tế bào nền, tế bào mô vú bình thường hoặc nguyên bào sợi rất khó phát triển lâu dài trong môi trường M171 không huyết thanh.
3.1.2. Hiệu quả nuôi cấy sơ cấp
Mảnh mô được nuôi trong môi trường M171 bắt đầu có tế bào mọc ra từ rìa mảnh mô sau năm ngày nuôi cấy. Trong quá trình nuôi cấy sơ cấp, có những mẫu khối u nuôi cấy trên 40 ngày mà không có tế bào nào phát triển sẽ bị loại bỏ. Mẫu khối u hầu như không bị nhiễm chỉ có 2/51 mẫu bị nhiễm ở ngày thứ 5 và 10. Hiệu quả nuôi cấy không nhiễm đạt 96,1% cho thấy phương pháp xử lý rửa mẫu bằng dung dịch PBS 10X kháng sinh cho hiệu quả cao, nên tiếp tục áp dụng cho những nghiên cứu phân lập dòng tế bào ung thư vú người Việt Nam từ nuôi cấy sơ cấp.
Nhóm nghiên cứu bắt đầu thu nhận mẫu khối u vú từ tháng 10/2011 đến tháng
12/2011 và thu được 51 mẫu. Đến thời điểm hiện nay (tháng 02/2012), trong 51 mẫu thu nhận có 39 mẫu có tế bào phát triển từ mảnh mô đạt hiệu quả nuôi cấy thành công 76,5%; có 21 mẫu duy trì hơn 40 ngày nhưng không có tế bào phát triển từ rìa mảnh mô bị loại bỏ vì quá hao phí môi trường nếu tiếp tục duy trì nữa. Các
mẫu không có tế bào phát triển đa phần là: mẫu nuôi cấy ban đầu khi khối u được xử lý thành những khối dày, to hoặc nuôi với mật độ dày quá (14-18 mảnh/bình nuôi); mẫu khối u có kích thước quá nhỏ; mẫu khối u có nhiều mỡ, sau khi xử lý sơ bộ vẫn còn mỡ lơ lửng trong bình nuôi gây cản trở sợ tăng sinh tế bào. Một số bệnh nhân khi phẫu thuật nhiều mô mỡ tại khối u, hoặc nhiều dịch nhầy, nhiều mạch máu nên mẫu khối u sau xử lý nhỏ và khó chọn vùng có khả năng tế bào tăng sinh tốt.
Bảng 3. 1. Thống kê hiệu quả nuôi cấy thành công
Số mẫu đã tiến hành Số mẫu có tế bào mọc Số mẫu không có tế bào mọc
51 39 12
Hiệu quả nuôi cấy (%) 76.47 23.53%
Đa phần các khối u có tế bào mọc lan trong giai đoạn 5-10 ngày (15 mẫu/39 mẫu chiếm tỷ lệ 38,5%) và gia đoạn 11-19 ngày (16 mẫu/39 mẫu chiếm tỷ lệ 41%). Phần lớn các mẫu này, tế bào phát triển tốt, mọc dày, lan rộng và có hình thái tương đối đồng nhất.
Hình 3. 8. Biểu đồ thống kê mẫu khối u có tế bào phát triển theo thời gian
Phần lớn các mẫu khối u được nuôi cấy có tế bào phát triển được thu từ bệnh nhân có độ tuổi còn trẻ (58% bệnh nhân dưới 50 tuổi). Mẫu khối u thu từ bệnh nhân lớn tuổi (78% bệnh nhân trên 50 tuổi) thường khó nuôi cấy hoặc không có tế bào phát triển sau hơn 40 ngày.
Hình 3. 9. Biểu đồ phân bốđộ tuổi của bệnh nhân cho mẫu khối u vú
Tất cả các mẫu ung thư phải được thu từ bệnh nhân ung thư từ giai đoạn II trở
lên, trong đó đa số là mẫu ở giai đoạn IIB. Hầu như không thấy sự tương quan rõ rệt giữa khả năng nuôi cấy thành công mẫu với giai đoạn ung thư. Tuy nhiên, những mẫu khối u có tế bào phát triển sớm thường là những mẫu ở giai đoạn IIB trở lên (88% ở giai đoạn IIB trở đi và chỉ 12% ở giai đoạn IIA), đặc biệt mẫu của bệnh nhân di căn ở giai đoạn IV chỉ sau 6 ngày nuôi cấy đã có tế bào mọc lan từ rìa mảnh mô và các tế bào này phát triển mạnh, có xu hướng hình thành cụm. Mẫu khối u không có tế bào phát triển thường ở giai đoạn sớm (33% ở giai đoạn IIA và chỉ 44% ở giai đoạn IIB).
3.1.3. Đánh giá quần thể tế bào ung thư vú sơ cấp
Hầu hết các mẫu khối u sau 30 ngày nuôi cấy có tế bào mọc lan rộng, phủ 70% bề mặt nuôi và được phân tách để chọn lọc tế bào ung thư vú ứng viên và tế bào gốc ung thư vú nuôi cấy tiếp và tạo dòng tế bào mong muốn. Từ ba mẫu nuôi cấy có hiệu quả tế bào phát triển tốt, sau khi phân tách và chọn lọc bằng marker CD44, CD24 và CD90 được kết quả sau:
Bảng 3. 2. Tỷ lệ tế bào ung thư và tế bào gốc ung thư vú trong quần thể tế bào sơ cấp
Mẫu % Tế bào gốc ung thư vú
(CD44+/CD24-)
% Tế bào ung thư vú ứng viên (CD90-)
Số 12 – Giai đoạn IV 19,69 79,84