3.7. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tách đƣợc từ chủng T. konilangbra
KS14
Các hợp chất thu đƣợc từ chủng T. konilangbra KS14 đƣợc xác định hoạt tính kháng VSV, hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ và hoạt tính chống oxy hóa, kháng VSV, hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ và hoạt tính chống oxy hóa, kháng VSV, hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ và hoạt tính chống oxy hóa, theo các phƣơng pháp đã trình bày ở chƣơng 2.
3.7.1. Hoạt tính kháng VSV
Bảng 3.13. trình bày hoạt tính kháng VSVKĐ của các hợp chất tách đƣợc, qua đó có thể nhận xét về từng chất nhƣ sau:
- Hợp chất KS14-1 (ergosterol) chỉ biểu hiện khả năng kháng nấm mốc A. niger với giá trị MIC=100 g/ml, mà khơng kháng các VSVKĐ cịn lại.
- Hợp chất KS14-2 (axit dehydraxetic) trong thử nghiệm của chúng tơi khơng có hoạt tính kháng với bất kỳ VSVKĐ nào, mặc dù theo tài liệu tham khảo, chất này đã từng đƣợc sử dụng nhƣ là chất diệt nấm cho hoa quả tƣơi và khô [56].
- Hợp chất KS14-3 (sorbixilin) biểu hiện hoạt tính kháng VSVKĐ rất tốt: kháng mạnh cả 4 loại vi khuẩn Gram (+), Gram (-), đặc biệt là kháng rất mạnh đối với 2 vi khuẩn B. subtilis và S. aureus, với giá trị MIC tƣơng ứng là 25 g/ml. Kết quả này phù hợp phần nào với hoạt tính kháng một số VSVKĐ cũng của chất này nhƣng đƣợc phân lập từ Penicillium notatum, công bố trong tài liệu [114].
- Hợp chất KS14-4 (axit 16-hydroxyoctadecanoic) biểu hiện hoạt tính kháng rất mạnh vi khuẩn S. aureus với MIC là 25 g/ml. Tuy không phải là một chất mới, nhƣng đây là dẫn liệu đầu tiên về hoạt tính kháng vi khuẩn S. aureus của hợp chất này.
- Hợp chất KS14-5 (ergosterol peroxit) có phổ kháng khuẩn, kháng nấm tƣơng đối rộng, ức chế đƣợc 7 trên 8 VSVKĐ gồm các VK Gram (+), Gram (-), nấm men và nấm mốc, với giá trị MIC là 100 g/ml đối với mỗi loại VSVKĐ. Ngồi ra theo tài liệu tham khảo thì hợp chất này cịn có hoạt tính kháng vi khuẩn lao [56].
Điều đáng chú ý là, dƣờng nhƣ chất nào có phổ kháng VSVKĐ rộng, nhƣ chất KS14-5 (ergosterol peroxit), thì có hoạt tính khơng mạnh lắm (MIC= 100 g/ml), trong khi đó chất nào có phổ kháng hẹp (nhƣ KS14-3 tức sorbixilin) hoặc rất hẹp (nhƣ KS14-4 tức axit 16-hydroxyoctadecanoic) thì có hoạt tính mạnh hoặc rất mạnh (MIC = 25 đến 50 và = 25, theo thứ tự). Chƣa thấy tài liệu nào đề cập đến vấn đề tƣơng tự nhƣ thế.
Bảng 3.13. Hoạt tính kháng VSV của các hợp chất tách đƣợc từ chủng T. konilangbra KS14 từ chủng T. konilangbra KS14 S T T KH mẫu
Nồng độ ức chế tối thiểu đối với các VSVKĐ, MIC (g /ml) Vi khuẩn Gram (-) Vi khuẩn Gram (+) Nấm mốc Nấm men E. coli P. aeruginosa B. subtilis S. aureus A. niger F. oxysporum C. albicans S. cerevisiae 1 KS14-1 (-) (-) (-) (-) 100 (-) (-) (-) 2 KS14-2 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 3 KS14-3 50 50 25 25 (-) (-) (-) (-) 4 KS14-4 (-) (-) (-) 25 (-) (-) (-) (-) 5 KS14-5 100 (-) 100 100 100 100 100 100
3.7.2. Hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thư
Năm hợp chất nói trên đƣợc thử nghiệm hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ gan, ung thƣ màng tử cung và ung thƣ cơ vân. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.14. Theo đó, 2 trong 5 chất thử nghiệm có hoạt tính gây độc tế bào:
- Hợp chất KS14-3 (sorbixilin) có hoạt tính gây độc tế bào với 2 dịng tế bào ung thƣ gan và ung thƣ cơ vân với IC50 tƣơng ứng là 5 và 4,91g /ml. Trong một nghiên cứu khác [61], chất này và các dẫn xuất của nó đƣợc tinh chế từ một chủng nấm Trichoderma sp. phân lập từ biển cịn có khả năng gây độc với dòng tế bào
HL-60.
- Hợp chất KS14-5 (ergosterol peroxit) biểu hiện hoạt tính gây độc mạnh đối với cả 3 dòng tế bào thử nghiệm là ung thƣ gan, ung thƣ màng tử cung và ung thƣ cơ vân với giá trị IC50 tƣơng ứng là 6,25; 7,5 và 6,8 g/ml. Theo một báo cáo khác thì chất này cịn có độc tính đối với hai dịng tế bào ung thƣ gan HTC và ZHC, dòng ung thƣ màng tử cung 3T3, dòng ung thƣ báng ở chuột Wallker 256, và dòng ung thƣ tuyến vú ngƣời MCF-7, trong thử nghiệm
độc một số dòng tế bào ung thƣ của chất này phân lập từ Nomuraea rileyi cũng
đƣợc công bố trong tài liệu [133].
Bảng 3.14. Hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ của các hợp chất tách đƣợc từ chủng T. konilangbra KS14 của các hợp chất tách đƣợc từ chủng T. konilangbra KS14 ST T Kí hiệu mẫu CS (Cell survival), %
đối với các dòng tế bào ung thƣ Giá trị IC50 (g/ml) đối với các dòng tế bào ung thƣ Hep-G2 Fl RD Hep-G2 Fl RD 1 Chứng (-) 100 0,0 100 0,0 100 0,0 2 Chứng (+) 2,5 1,07 2,0 0,09 2,3 0,60 0,2 0,4 0,25 3 KS14-1 79,490,7 82,51,9 75,60,06 >10 >10 >10 4 KS14-2 77,50,45 72,62,1 93,140,2 >10 >10 >10 5 KS14-3 38,40,1 80,22,7 25,750,8 5 >10 4,91 6 KS14-4 70,230,4 83,32,5 79,041,0 >10 >10 >10 7 KS14-5 32,751,5 42,50,07 41,450,5 6,25 7,5 6,8 3.7.3. Hoạt tính chống oxy hố
Hoạt tính chống ôxy hóa của năm hợp chất nói trên đƣợc ghi ở bảng 3.15 cho thấy cả 5 hợp chất đều khơng có khả năng chống oxy hóa trên hệ DPPH. Trong khi đó, ở mục 3.4.3, bảng 3.6, đã thấy rằng cặn chiết etylaxetat của chủng T. konilangbra KS14 có hoạt tính chống oxy hóa, với SC(%) > 66. Có lẽ hoạt tính chống oxy hóa này thuộc về các phân đoạn khác (các phân đoạn 2, 3, 7, 8) của cặn chiết nói trên khơng đƣợc tách theo qui trình ở hình 2.4.
Bảng 3.15. Hoạt tính chống oxy hoá của các hợp chất tách đƣợc từ chủng T. konilangbra KS14 từ chủng T. konilangbra KS14
STT Kí hiệu mẫu SC (%) Kết luận
1 Chứng (+) 64,050,2 Dƣơng tính 2 Chứng (-) 0,00,0 Âm tính 3 KS14-1 3,670,2 Âm tính 4 KS14-2 6,670,4 Âm tính 5 KS14-3 8,230,06 Âm tính 6 KS14-4 8,230,7 Âm tính 7 KS14-5 2,50,05 Âm tính
Nhƣ vậy, trong 5 hợp chất phân lập đƣợc từ chủng T. konilangbra KS14 nội
sinh trên cây khổ sâm thì có 2 hợp chất là sorbixilin và ergosterol peroxit có hoạt tính kháng mạnh các chủng VSVKĐ và đồng thời có hoạt tính gây độc tế bào với giá trị IC50 cao. Hoạt tính “kép” này của mỗi chất làm tăng thêm giá trị ứng dụng của nó; đồng thời nếu những chất này đƣợc sản xuất ở qui mô thƣơng mại bằng con đƣờng lên men để sau đó tinh chế thì hoạt tính kép của chúng có thể góp phần làm giảm đáng kể chi phí sản xuất.
3.7.4. So sánh hoạt tính của sorbixilin và ergosterol peroxit với ent-7β-hydroxy-18-axetoxy-kaur-16-en-15-on 18-axetoxy-kaur-16-en-15-on
Một điều rất đáng chú ý là, 2 hợp chất tách đƣợc trên đây từ chủng nấm nội sinh T. konilangbra KS14, sorbixilin và ergosterol peroxit, có những hoạt tính giống nhƣ các ent-kauran phân lập đƣợc từ cây khổ sâm: theo tài liệu [6, 7] thì các ent- kauran phân lập đƣợc từ cây khổ sâm, đặc biệt là ent-7β-hydroxy-18-axetoxy-kaur- 16-en-15-on, có hoạt tính kháng VSV mạnh với phổ tác dụng rất rộng, kháng đƣợc các vi khuẩn và nấm, ngồi ra cịn thể hiện hoạt tính gây độc mạnh với một số dòng tế bào ung thƣ ngƣời nhƣ ung thƣ gan, ung thƣ tử cung, ung thƣ cơ vân. Sự so sánh các hoạt tính này của 2 chất sorbixilin và ergosterol peroxit do chúng tôi phân lập
đƣợc từ NNS của cây khổ sâm với ent-7β-hydroxy-18-axetoxy-kaur-16-en-15-on từ cây chủ (khổ sâm) của hai tài liệu vừa dẫn đƣợc nêu trong bảng 3.16. Qua đó thấy rằng hai chất nói trên từ chủng NNS T. konilangbra KS14 có phần lớn các hoạt tính kháng VSV và gây độc tế bào ung thƣ của một chất ent-kauran tách từ cây khổ sâm theo các tài liệu đã dẫn. Ngoài ra, chất ergosterol peroxit do chúng tôi phân lập từ NNS còn kháng nấm Candida albicans và Saccharomyces cerevisiae mà chất từ
cây chủ không kháng.
Sự tƣơng đồng nhƣ trên về các hoạt tính kháng VSV, gây độc các dòng tế bào ung thƣ giữa sorbixilin và ergosterol peroxit từ NNS T. konilangbra KS14 của cây khổ sâm với ent-7β-hydroxy-18-axetoxy-kaur-16-en-15-on của chính cây đó, mặc dù cấu trúc hóa học của chúng khác nhau, là một vấn đề chƣa đƣợc đề cập trong các tài liệu đã công bố. Có thể giả thuyết sự tƣơng đồng về hoạt tính này là q trình chuyển hóa sinh học của các tiền chất từ cây chủ (hoặc ngƣợc lại có thể từ VSVNS) để tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, để kết luận chính xác giả thuyết này, cần có nhiều thời gian hơn và phải có sự kết hợp giữa nghiên cứu sinh học, hóa học và sinh thái học.
Những nghiên cứu trên đây của chúng tôi về cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất tách đƣợc từ một chủng NNS trên cây khổ sâm ở Việt Nam là nghiên cứu đầu tiên thuộc loại này, và qua đó đã phát hiện một số điều mới lạ, nhƣ: hoạt tính kháng tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus của axit 16-
hydroxyoctadecanoic; hay sự tƣơng đồng đáng kể về hoạt tính kháng 8 loại VSVKĐ và gây độc một số dòng tế bào ung thƣ, giữa sorbixilin và ergosterol peroxit từ một chủng NNS của cây khổ sâm với hai hoạt tính đó đã đƣợc biết từ trƣớc của một chất ent-kauran của cây đó.
Bảng 3.16. So sánh hoạt tính của các hợp chất tách
từ chủng nấm T. konilangbra KS14 và hợp chất tách từ cây khổ sâm
Chất tách từ cây khổ sâm
Các chất tách từ chủng nấm
T. konilangbra KS14
nội sinh trên cây khổ sâm
CHẤT CHÍNH ent-7β-hydroxy-18-axetoxy-kaur- 16-en-15-on HO O O 3 5 6 7 19 18 1 9 17 20 22 23 26 27 28 12 H 1 Ergosterol peroxit O CH3 CH3 HO H3C OH 1' 2' 3' 4' 5' 6' 6 1 2 3 5 4 Sorbixilin HOẠT TÍNH SINH HỌC Hoạt tính kháng VSVKĐ (MIC, g/ml) VSVKĐ ent-7β-hydroxy-18- axetoxy-kaur-16-en-15- on E. coli (-) P. aeruginosa 50 B. subtilis 12,5 S. aureus 12,5 A. niger 50 F. oxysporum 25 C. albicans (-) S. cerevisiae (-) Hoạt tính kháng VSVKĐ (MIC, g/ml)
VSVKĐ Ergosterol peroxit Sorbixilin
E. coli 100 50 P. aeruginosa (-) 50 B. subtilis 100 25 S. aureus 100 25 A. niger 100 (-) F. oxysporum 100 (-) C. albicans 100 (-) S. cerevisiae 100 (-)
Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ
Dịng tế bào IC50 (g/ml)) ent-7β-hydroxy- 18-axetoxy-kaur- 16-en-15-on KB 0, 05 Fl 0,1 RD 0,121
Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ
Dịng tế bào IC50
(g/ml)) Ergosterol peroxit Sorbixilin
Hep-G2 6,25 5
Fl 7,5 >10
RD 6,8 4,91
3.8. Tác dụng của chế phẩm T. konilangbra KS14 đối với cây khổ sâm
Để thăm dò khả năng tác động của NNS lên cây chủ, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm tác dụng của chế phẩm từ chủng nấm T. konilangbra KS14 trên các cành chiết của cây khổ sâm và theo dõi sự biến động hàm lƣợng của nhóm chất ent- kauran trên các mẫu thí nghiệm. Trong thử nghiệm của chúng tơi, chế phẩm dạng lỏng và dạng bột của chủng nấm nội sinh này đƣợc ủ vào bầu đất của các cành chiết từ cây khổ sâm. Sau 3 tháng theo dõi, các mẫu cây thí nghiệm đƣợc thu hoạch, đƣợc chiết bằng dung mơi thích hợp để thu lấy các cặn chiết. Những cặn chiết này là nguyên liệu để xác định hàm lƣợng nhóm chất ent-kauran. Đồng thời bộ rễ của các cây thí nghiệm (cành chiết) đƣợc tính tổng chiều dài trung bình.
Số liệu phân tích sau 3 tháng cho thấy, hàm lƣợng ent-kauran cũng nhƣ chiều dài trung bình bộ rễ ở 3 cơng thức có sự khác biệt rõ rệt (bảng 3.17, và 3.18). Theo đó, hàm lƣợng ent-kauran của các cơng thức xử lí bằng chế phẩm dạng lỏng, dạng bột và đối chứng lần lƣợt là 22,37; 13,92 và 14,87%, chiều dài trung bình bộ rễ cũng lần lƣợt là 25; 25 và 20 cm.
Bảng 3.17. Chất lƣợng cành chiết khổ sâm 3 tháng tuổi dƣới tác dụng của các chế phẩm T. konilangbra KS14 dƣới tác dụng của các chế phẩm T. konilangbra KS14
Kí hiệu mẫu phân tích Số bầu chiết Hàm lƣợng chất ent-kauran (%)
Chiều dài trung bình của bộ rễ (cm)
C2 (mẫu chứng) 10 14,87 20
T1.2 (dạng lỏng) 10 22,37 25
Bảng 3.18. Dữ liệu phân tích hàm lƣợng ent-kauran của các mẫu cành chiết khổ sâm của các mẫu cành chiết khổ sâm
Mẫu C2 Mẫu T1.2 Mẫu T2.2 Thành phần chính ent-kauran Thành phần chính ent-kauran Thành phần chính ent-kauran
Nhƣ vậy, chế phẩm dạng lỏng làm tăng hàm lƣợng ent-kauran mạnh hơn so với chế phẩm dạng bột (tăng 50,43% so với đối chứng), và làm tăng chiều dài bộ rễ tƣơng đƣơng tác dụng của chế phẩm dạng bột (tăng 25% so với đối chứng). Hai hiện tƣợng này có thể đƣợc lí giải dựa vào hai giả thiết tƣơng ứng sau đây:
a) Các sản phẩm của nấm Trichoderma konilangbra KS14 mà làm thay đổi
trao đổi chất của cây khổ sâm (tăng hàm lƣợng ent-kauran) phần lớn là sản phẩm ngoại bào (tiết vào môi trƣờng nuôi) cho nên chế phẩm dạng lỏng chứa chúng nhiều hơn so với trong khuẩn ty nấm này. Hơn nữa, nấm tiết mạnh các sản phẩm ngoại bào nhƣ vậy có lẽ là một kết quả của quá trình cộng sinh lâu dài (tiến hóa) với cây: trải qua tiến hóa lâu dài đó, NNS đã tạo đƣợc cơ chế tiết các sản phẩm ngoại bào để tƣơng tác với cây, làm thay đổi trao đổi chất của cây. Nếu giả thiết này đƣợc chứng minh thì đây sẽ là một vấn đề đáng chú ý về lý thuyết, liên quan đến quan hệ của nấm nội sinh với cây, đồng thời rất có giá trị thực tiễn vì việc khai thác các sản phẩm ngoại bào là dễ dàng và ít tốn kém hơn rất nhiều so với các sản phẩm nội bào.
b) Chế phẩm dạng bột có thể chứa các bào tử hoặc các đoạn khuẩn ty của nấm này, những yếu tố này dễ dàng cộng sinh trực tiếp với rễ cây, kích thích sinh trƣởng rễ, bù lại việc thiếu hụt hàm lƣợng các sản phẩm ngoại bào của nấm so với chế phẩm dạng lỏng.
Mặc dù đó mới là những giả thiết nảy ra từ những nghiên cứu trên và những giả thiết ấy gợi ý những nghiên cứu tiếp theo, nhƣng những nghiên cứu trên đây đã là những nghiên cứu đầu tiên về quan hệ nội cộng sinh giữa nấm Trichoderma
konilangbra với cây khổ sâm. Những số liệu đã thu đƣợc đã có thể có một số giá trị
trong thực tiễn nhƣ:
- Một là, có thể tạo đƣợc các chế phẩm nấm Trichoderma konilangbra KS14 để làm tăng chất lƣợng cây thuốc khổ sâm (tăng hàm lƣợng chất ent-kauran và tăng chiều dài hệ rễ của cành chiết).
- Hai là, qua đó có thể cải thiện đáng kể kỹ thuật nhân giống cây khổ sâm bằng cành chiết, nghĩa là góp phần tăng năng suất cây thuốc này.
- Ba là, từ các nấm của chế phẩm đã cộng sinh với các cây khổ sâm đƣợc nhân giống qua chiết cành nhƣ vậy cũng có thể khai thác các chất có giá trị (ví dụ các chất kháng vi sinh vật, gây độc tế bào ung thƣ, chống oxy hóa, các enzym ngoại bào...), thay vì phải chặt các cây này để khai thác những chất ấy. Cũng theo nguyên tắc này có thể khai thác các chất có hoạt tính sinh học quý khác, kể cả từ NNS với các cây khó trồng và cần nhiều thời gian và kinh phí, từ lúc nuôi cấy mô đến khi trồng đại trà. Điều này phù hợp với ý tƣởng cho rằng việc khai thác các hoạt chất từ nấm nội sinh, nhất là NNS của cây thuốc và các cây q hiếm khác, góp phần làm giảm tác động nặng nề của con ngƣời lên những cây chủ của nó vốn cho những hoạt chất này và đang bị khai thác ngày càng nhiều - do đó cũng cần đƣợc bảo tồn cùng với hệ NNS của chúng.
- Bốn là, thông qua việc nhân giống và lên men bằng chủng nấm
Trichoderma konilangbra KS14 để tạo chế phẩm xử lí cành chiết khổ sâm mà nguồn gen vi sinh vật q hiếm này đƣợc bảo tồn.
Ngồi các kết quả đã trình bày ở trên thì chủng Trichoderma konilangbra