trên các bộ phận của cây khổ sâm
3.1.2. Các chủng nấm nội sinh từ cây bùm bụp
Từ các bộ phận khác nhau của cây bùm bụp (lá, cành, bầu rễ, thân), chúng tôi đã phân lập đƣợc 24 chủng nấm nội sinh, với các đặc điểm đƣợc nêu dƣới đây
Màu sắc khuẩn lạc: Kết quả phân lập nấm và phân nhóm theo màu sắc đƣợc
ghi trong hình 3.3 và phụ lục 3. Theo đó, cũng giống nhƣ trên cây khổ sâm, trên cây bùm bụp tần suất xuất hiện của các chủng màu trắng là nhiều nhất (13 chủng), tiếp đến là các chủng màu đen (5 chủng), màu xanh (4 chủng), và ít nhất vẫn là màu vàng nâu (2 chủng). Tuy nhiên, nếu so sánh về màu sắc khuẩn lạc giữa cây khổ sâm và cây bùm bụp thì ở cây bùm bụp các chủng có khuẩn lạc màu trắng chiếm ƣu thế cao hơn hẳn (13/24 chủng) so với cây khổ sâm (11/31 chủng).
0 2 4 6 8 10 12 14
Đen Trắng Xanh Vàng nâu
5 13 4 2 S ố lư ợ n g c h ủ n g Nhóm màu sắc khuẩn lạc Hình 3.3. Các nhóm màu sắc khuẩn lạc của các chủng nấm nội sinh từ cây bùm bụp
Phân bố nấm nội sinh trên cây: Tƣơng tự nhƣ ở cây khổ sâm, nấm đƣợc
phân bố ở tất cả các bộ phận đã lấy mẫu của cây bùm bụp (hình 3.4). Điều khác biệt là các chủng nấm này đƣợc phân lập từ thân và lá nhiều hơn so với từ rễ.
0 2 4 6 8 10 5 9 10 S ố lư ợ n g ch ủ n g Các bộ phận của cây Rễ Lá Thân
Hình 3.4. Sự phân bố các chủng nấm nội sinh trên các bộ phận của cây bùm bụp trên các bộ phận của cây bùm bụp
Tính tổng cộng từ 2 loại cây khổ sâm và bùm bụp, chúng tôi đã phân lập đƣợc 55 chủng nấm nội sinh. Các chủng nấm phân lập đƣợc chỉ tập trung vào 4 nhóm màu sắc khuẩn lạc là trắng, đen, xanh và vàng nâu. Trong đó các chủng màu
trắng và màu đen chiếm số lƣợng cao nhất, 44% và 25% theo thứ tự, các chủng màu xanh là 20% và các chủng màu vàng nâu 11%. Tính tổng cộng, các chủng nấm nội sinh phân lập đƣợc trên các bộ phận khác nhau của 2 cây này đƣợc phân bố theo tỉ lệ nhƣ sau (%): thân 38, rễ 31, lá 25,5, còn lại là từ quả 5,5.
Các kết quả này phù hợp với một nghiên cứu khác, theo đó NNS thực vật bao gồm nhiều loài đƣợc phân lập chủ yếu từ thân, rễ và lá [57].
Tuy nhiên cũng có nghiên cứu khác chỉ ra rằng NNS thực vật tập trung nhiều nhất ở ngọn, thân, lá và xuất hiện ít nhất ở rễ [172].
Các kết quả về phân lập nấm trên 2 cây này chứng tỏ rằng cây thuốc là chủ thể cho một số lồi nấm nội sinh khác nhau có thể sinh sống. Trên các cây chủ khác nhau thì tỉ lệ về màu sắc và số lƣợng các chủng nấm nội sinh phân lập đƣợc cũng khác nhau.
Đây là những khảo sát đầu tiên về hệ nấm nội sinh trên cây khổ sâm và bùm bụp tại Việt Nam.
3.2. Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng NNS phân lập đƣợc
Nấm nội sinh trong q trình sống có thể tạo ra nhiều chất giúp thực vật chủ đề kháng tốt hơn với ngoại cảnh bất lợi, đặc biệt là sâu hại và mầm bệnh. Nhiều nấm nội sinh có khả năng sinh các chất kháng các tác nhân gây bệnh. Vì vậy, trong khn khổ luận án này, các chủng nấm sau khi đƣợc phân lập và quan sát hình thái, đã tiếp tục đƣợc đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật theo phƣơng pháp thỏi thạch để sàng lọc, tuyển chọn các chủng có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, cho các định hƣớng nghiên cứu tiếp theo. Kết quả sàng lọc và tuyển chọn các chủng nấm có hoạt tính từ hai cây khổ sâm và bùm bụp đƣợc nêu trong các bảng 3.1 và 3.2.
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy NNS phân lập từ cây khổ sâm có hoạt tính kháng VSV với tỉ lệ cao và phổ kháng khuẩn và kháng nấm của chúng là khá rộng. Cụ thể là, trong số 31 chủng nấm NNS phân lập đƣợc có 10 chủng có hoạt tính kháng từ 5 VSVKĐ trở lên, chiếm tỷ lệ cao nhất (32,3%), 6 chủng kháng từ 3 đến 4 VSVKĐ (19,3% ), 8 chủng kháng từ 1 đến 2 VSVKĐ (25,8%), và 7 chủng khơng biểu hiện hoạt tính (22,6%).
Trong số các chủng có hoạt tính cao, chủng KS14 biểu hiện hoạt tính nổi trội, kháng cả 8 VSVKĐ với đƣờng kính các vịng kháng khuẩn và kháng nấm lớn nhất so với các chủng còn lại. Tiếp theo là 9 chủng có kí hiệu KS6, KS9, KS10, KS15, KS17, KS18, KS19, KS24, KS33, là những chủng có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tốt nhất trong số 31 chủng nấm đã phân lập trên cây khổ sâm.
Trong khi đó, 24 chủng NNS của cây bùm bụp (bảng 3.2) biểu hiện hoạt tính yếu hơn và phổ kháng khuẩn, kháng nấm hẹp hơn: chỉ có 3 trong tổng số 24 chủng nấm phân lập đƣợc có hoạt tính kháng từ 5 VSVKĐ trở lên (chiếm 12,5%). Có 13 chủng kháng từ 1-3 VSVKĐ (chiếm đa số, 54,2%), và 8 chủng khơng có hoạt tính (33,3%). Tuy nhiên, chúng tơi cũng đã lựa chọn đƣợc 2 chủng có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tốt, là các chủng có kí hiệu MB8 và MR2 trong tổng số 24 chủng nấm phân lập đƣợc.
Bảng 3.1. Hoạt tính kháng VSVKĐ của các chủng nấm phân lập từ cây khổ sâm phân lập từ cây khổ sâm
ST T Kí hiệu mẫu Hoạt tính kháng VSVKĐ (D-d, mm)
Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (+) Nấm mốc Nấm men
E. coli P. aeruginosa B. subtilis S. aureus A. niger F. oxysporum C. albicans S. cerevisiae 1 KS1 0 0 0 0 0 8 0 0 2 KS2 4 0 0 0 0 2 0 0 3 KS3 0 0 0 0 0 5 0 0 4 KS4 0 0 0 0 0 0 5 6 5 KS6 27 22 21 21 22 20 0 22 6 KS8 0 0 3 0 10 8 0 0 7 KS9 13 14 13 13 7 9 0 0 8 KS10 19 17 16 17 1 2 0 3 9 KS11 2 0 3 0 0 7 0 2 10 KS12 9 15 9 8 0 0 0 0 11 KS13 0 0 0 0 0 0 0 0 12 KS14 35 30 33 34 10 15 12 10 13 KS15 10 2 13 25 10 8 0 0 14 KS16 10 0 0 0 8 0 0 0 15 KS17 13 0 10 3 10 0 0 12 16 KS18 26 3 32 23 15 9 0 0 17 KS19 23 0 5 8 0 7 5 0 18 KS20 10 0 0 10 0 0 0 0 19 KS21 0 0 0 0 0 0 0 0 20 KS22 10 10 10 10 0 0 0 0 21 KS23 15 0 0 10 0 0 0 0 22 KS24 20 0 11 15 0 0 5 7 23 KS25 10 0 10 5 0 0 0 0 24 KS26 3 0 5 0 0 0 0 0 25 KS27 0 0 0 4 5 2 0 0 26 KS28 0 0 0 0 0 0 0 0 27 KS29 0 0 0 0 0 0 0 0 28 KS30 0 0 0 0 0 0 0 0 29 KS31 0 0 0 0 0 0 0 0 30 KS32 0 0 0 0 0 0 0 0 31 KS33 19 0 16 17 12 2 0 3
Bảng 3.2. Hoạt tính kháng VSVKĐ của các chủng nấm phân lập từ cây bùm bụp phân lập từ cây bùm bụp ST T Kí hiệu mẫu Hoạt tính kháng VSVKĐ (D-d, mm) Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (+) Nấm mốc Nấm men E. coli P. aeruginosa B. subtilis S. aureus A. niger F. oxysporum C. albicans S. cerevisie 1 MB1 0 0 0 0 0 8 0 0 2 MB2 4 0 0 0 0 2 0 0 3 MB3 0 0 0 0 0 5 0 0 4 MB4 0 0 0 0 0 0 5 6 5 MB5 0 0 0 0 6 4 0 0 6 MB6 0 0 0 8 0 8 0 0 7 MB7 0 0 0 0 0 6 0 0 8 MB8 17 0 21 11 22 0 18 0 9 MB9 0 0 13 0 0 0 0 0 10 MB10 0 0 0 0 0 0 0 0 11 MB11 0 0 0 0 0 0 0 0 12 M1 0 0 0 0 8 9 0 0 13 M2 5 0 0 0 7 4 0 0 14 M3 0 0 0 0 0 0 0 0 15 MA1 0 0 0 0 0 0 0 0 16 MA2 0 0 0 0 0 10 0 0 17 MA3 0 0 0 0 10 0 5 0 18 MA4 0 0 0 12 0 0 0 0 19 MT1 3 0 4 7 13 0 5 0 20 MR1 0 0 0 0 0 0 0 0 21 MR2 15 0 10 12 5 0 3 5 22 ML1 0 0 0 0 0 0 0 0 23 ML2 0 0 0 0 0 0 0 0 24 ML3 0 0 0 0 0 0 0 0
Nhận xét chung về kết quả sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật:
a) Tổng cộng có 40 trong 55 chủng nấm nội sinh của 2 cây khổ sâm và bùm bụp có hoạt tính kháng từ 1 đến 8 trên 8 loại VSVKĐ. Điều này chứng tỏ tiềm năng kháng VSV của các nấm nội sinh trên 2 cây thuốc này là khá cao.
b) Một điều rất đáng chú ý là, về hoạt tính kháng VSV, tập hợp các NNS trên cây khổ sâm dƣờng nhƣ “hoạt động” hơn các NNS trên cây bùm bụp, cụ thể nhƣ sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Trong số 31 chủng NNS đƣợc sàng lọc của cây khổ sâm, với 8 VSVKĐ (31x8 = 248 lần thử), thì tỉ lệ dƣơng tính là 96/248 = 0,39; tỷ lệ này ở 24 chủng NNS của cây bùm bụp là 37/192 = 0,19.
- 10 trong 31 chủng NNS của cây khổ sâm (0,32) kháng từ 5 VSVKĐ trở lên so với 3 trong 24 chủng NNS của cây bùm bụp (0,13).
- Chủng KS14 của cây khổ sâm kháng 8 trong 8 VSVKĐ, trong khi đó chủng tốt nhất của cây bùm bụp (chủng MR2) kháng 6 trong 8 VSVKĐ. Ngồi ra phần lớn các vịng kháng khuẩn, kháng nấm của chủng KS14 là lớn hơn rất nhiều so với của tất cả các chủng cịn lại.
Tính hoạt động hơn này của các NNS trên cây khổ sâm so với NNS trên cây bùm bụp liệu có liên quan gì đến sinh học của hai loài cây này cũng nhƣ có liên quan gì đến mơi trƣờng sinh thái của chúng? Câu hỏi này vẫn còn bỏ ngỏ cho tới khi có thêm nhiều nghiên cứu về sinh lý học và sinh thái học thực vật cũng nhƣ sinh thái học vi sinh vật đối với hai cây thuốc này.
Cuối cùng, trong số 55 chủng nấm đã phân lập, chúng tơi lựa chọn đƣợc 10 chủng có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tốt (kháng từ 5 VSVKĐ trở lên), trong đó có 8 chủng từ cây khổ sâm là các chủng KS6, KS14, KS15, KS17, KS18, KS19, KS24, KS33, và 2 chủng từ cây bùm bụp là MB8, MR2. Các chủng này đƣợc sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Phân loại các chủng nấm nội sinh bằng phƣơng pháp hình thái và bằng phƣơng pháp sinh học phân tử phƣơng pháp sinh học phân tử
3.3.1. Phân loại các chủng NNS bằng phương pháp hình thái
Các chủng nấm lựa chọn đƣợc cấy trên đĩa thạch khoai tây hoặc Czapek- Dox. Quan sát các đặc điểm hình thái (màu sắc khuẩn lạc, bào tử, thể bình, giá sinh bào tử…) và định danh chúng bằng các khóa phân loại hiện đang đƣợc sử dụng theo các tài liệu [32, 58].
Mô tả chi tiết các chủng nấm đã đƣợc phân loại bằng phƣơng pháp hình thái nhƣ sau:
3.3.1.1. Chủng KS6
Khuẩn lạc: màu trắng, sau lục sẫm, lục xanh.
Thể bình: xếp thành cụm 2-4 cái ở đỉnh các nhánh tận cùng, đôi khi đơn độc.
Có đƣờng kính lớn nhất ở khoảng giữa, hơi thon nhỏ đến gốc và thon nhỏ thành cổ hình trụ ở phần ngọn, thẳng hoặc cong, khơng màu. 2,5-3,5 x 6-18µm.
Bào tử áo: ở giữa sợi nấm, hình cầu, khơng màu, nhẵn, đƣờng kính 6-14µm. Bào tử trần: hình cầu, gần cầu, thành khối cầu nhỏ ở miệng thể bình khơng
ngăn vách, màu lục nhạt, có gai, 3,5- 4,0µm x 3,5- 4,0µm.
Giá bào tử trần: ngăn vách, không màu, phân nhánh nhiều lần, các nhánh
đơn độc hoặc thành cụm 2-3 cái, đƣờng kính 4-5µm, dài tới 250µm.
Được định tên là: Trichoderma viride Pers. ex Gray
Hình 3.5. Ảnh hiển vi của Trichoderma viride KS6 (x400)
3.3.1.2. Chủng MB8
Khuẩn lạc: màu lục trắng, sau lục tƣơi, lục sẫm. Mặt trái khuẩn lạc khơng
màu.
Thể bình: thƣờng thành cụm 2-5 cái ở đỉnh nhánh tận cùng, hoặc đơn độc ở
dọc các nhánh. Thể bình ở giữa thƣờng dài tới 17µm và có đƣờng kính nhỏ hơn 2- 3µm ở phần rộng nhất; 3-4 x 5-7µm.
Bào tử áo: ở giữa sợi nấm hoặc ở đỉnh các nhánh, hình cầu, nhẵn, khơng
màu, đƣờng kính 6-12µm.
Bào tử trần: hình gần cầu, hình trứng, phần gốc hơi bẹt, nhẵn, màu lục nhạt,
không ngăn vách., thành khối cầu, nhày ở đỉnh thể bình; 2,5-3,0 x 3,0-3,5µm.
Giá bào tử trần: ngăn vách, phân nhánh 2-3 lần, đƣờng kính 4-5µm, dài tới
250µm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Được định tên là: Trichoderma harzianum Rifai
Hình ảnh hiển vi của chủng Trichoderma harzianum MB8 đƣợc dẫn ở hình
Hình 3.6. Ảnh hiển vi của Trichoderma harzianum MB8 (x400)
3.3.1.3. Chủng KS14
Khuẩn lạc: màu lục nhạt. Mặt trái và môi trƣờng xung quanh màu vàng lục. Thể bình: khơng thành cụm, khơng mập, hơi thót đáy.
Bào tử trần: hầu hết hình elíp, 3-7,5 x 3-3,5µm.
Giá bào tử trần: cuống sinh bào tử trần và các nhánh dài, khơng dày Được định tên là: Trichoderma sp.
Hình ảnh hiển vi của chủng Trichoderma KS14 đƣợc dẫn ở hình 3.7.
Điều đặc biệt là, do các đặc điểm hình thái của chủng KS14 và với các khóa phân loại mà chúng tơi hiện có, chủng này chỉ đƣợc định tên đến chi. Vì những lẽ đó chủng này tiếp tục đƣợc định tên đến loài bằng phƣơng pháp sinh học phân tử và đƣợc định rõ vị trí trên cây phân loại (mục 3.3.2).
3.3.1.4. Chủng KS15
Khuẩn lạc: màu trắng hoặc vàng nhạt đến da bị. Mặt trái khơng màu đến
màu vàng. Trên mơi trƣờng Czapek mọc chậm, đƣờng kính 1,5-2cm/ 2 tuần ở nhiệt độ phịng,
Giọt tiết: khơng có, khơng mùi.
Chổi: ít, dị thƣờng, sắp xếp khơng đều.
Thể bình: đơn độc hoặc thành nhóm 2-3 cái, 10-15 x 2,5-3,5µm.
Bào tử túi: hình hạt đậu, có gai và có gờ và mào xích đạo; 3,5-4,5 x 3,0-
3,5µm.
Bào tử trần: hình elíp đến gần cầu, với 2 đầu bào tử hơi nhọn; 4,0-5,0 x 3,5-
4,0µm.
Được định tên là: Penicillium ehrlichii Klebahn
Hình ảnh hiển vi của chủng Penicillium ehrlichii KS15 đƣợc dẫn ở hình 3.8.
3.3.1.5. Chủng KS17
Khuẩn lạc: màu xám kim loại, xám oliu tối, mặt dạng nhung, mặt trái màu vàng đến màu da cam sẫm; trên môi trƣờng Czapek phát triển khá chậm, đƣờng kính 2,5-3,0cm/10 ngày ở nhiệt độ phịng.
Thể bình: Cuống thể bình tẽ, kích thƣớc 8-12 x 2,5-3,0µm; thể bình tạo thành
vịng 6-12 cái có kích thƣớc 7-8 x 2,2µm.
Bào tử trần: hình cầu, gần cầu, có gai; 3,0-3,5 µm
Giá bào tử trần: nhẵn hoặc hơi ráp tạo thành các hạt, rộng 2,5-3,0µm, phát
triển từ hệ sợi nền dài 75- 200µm, hoặc từ các sợi nấm khí sinh dài 50- 75µm.
Được định tên là: Penicillium nigricans (Bainier) Thom
Hình ảnh hiển vi của chủng Penicillium nigricans KS17 đƣợc dẫn ở hình 3.9. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.9. Ảnh hiển vi của Penicillium nigricans KS17 (x400)
3.3.1.6. Chủng KS18
Khuẩn lạc: màu lục xanh, lục, mặt dạng nhung, đôi khi xốp bông nhẹ, nhiều
rãnh xuyên tâm. Mặt trái khuẩn lạc màu vàng, vàng da cam, môi trƣờng xung quanh màu vàng chanh, vàng tím; đƣờng kính 2,0-2,5cm.
Giọt tiết: màu vàng tƣơi nhạt.
Chổi: hiếm khi tạo thành chổi 3 tầng.
Thể bình: xếp thành 4-10 chiếc, có kích thƣớc 8-10 x 2,0-2,5µm; cuống thể
Bào tử trần: hình cầu, gần cầu, nhẵn, 2,5-3,0µm, xếp thành dạng cột dài
150µm.
Giá bào tử trần: nhẵn, phần lớn phát triển từ hệ sợi nền, kích thƣớc 120-250
x 2,5-3,0µm; hoặc phát triển từ các sợi nấm khí sinh, kích thƣớc 40-100 x 2,5- 3,0µm. Thƣờng khơng có nhánh, đơi khi mang một nhánh; nhánh nhẵn, kích thƣớc 20-35 x 2,5-3,0µm; ngọn giá thƣờng mang một vòng 3-5 cuống thể bình ít nhiều phân ly.
Được định tên là: Penicillium citrinum Thom
Hình ảnh hiển vi của chủng Penicillium citrinum KS18 đƣợc dẫn ở hình
3.10.
Hình 3.10. Ảnh hiển vi của Penicillium citrinum KS18 (x400)
3.3.1.7. Chủng KS19
Khuẩn lạc: mặt dạng nhung hoặc xốp nhẹ, mép màu trắng, trung tâm có màu
vàng hoặc màu lục lơ của các đầu sinh bào tử trần. Mặt trái màu da cam đến nâu vàng; trên môi trƣờng Czapek mọc chậm, kích thƣớc 2-3cm/2 tuần ở nhiệt độ phòng,
Giọt tiết: thƣờng khơng có.
Chổi: thƣờng 2 tầng và đối xứng, sinh ra trên các trên các giá sinh bào tử trần
từ sợi nền; có 5-7-8 nhánh, kích thƣớc 10-12 x 1,5-2,0µm.