CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Các chất có hoạt tính sinh học từ nấm nội sinh
1.3.2. Các chất kháng vi sinh vật
Dƣới đây là một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật của nấm nội sinh.
- Trong số 31 chủng NNS dạng nấm sợi phân lập từ 3 cây thuốc ở Khu Dự Trữ Sinh Quyển Similipal, Ấn Độ, có 13 chủng (41,9%) thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật, ức chế ít nhất một VSV gây bệnh kiểm định; trong số các chủng kháng mạnh, có 19,3% thể hiện cả hai hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm, và 6,4% kháng tất cả các VSV gây bệnh kiểm định [118]. Các tác giả của nghiên cứu này tái khẳng định quan điểm cho rằng NNS của các cây thuốc dân tộc có thể là nguồn đầy triển vọng về các chất kháng VSV.
- Từ NNS Penicillium sp. của lá cây Hopea hainanensis (Dipterocarpaceae) -
một cây bản địa của đảo Hải Nam, Trung Quốc, đã tách đƣợc 6 chất: monometylsulocrin (1), axit rhizoctonic (2), asperfumoit (3), physcion (4), 7,8-iso- aloxazin (5), và axit 3,5-dicloro-p-anisic (6) [170]. Tất cả 6 chất đã đƣợc nghiên cứu
in vitro về tác dụng chống 3 nấm gây bệnh cho ngƣời (Candida albicans, Trichophyton rubrum, và Aspergillus niger). Kết quả là các chất số 2- 4 và 6 ức chế
sinh trƣởng của C. albicans, với các MIC 40, 20, 50, và 15 µg/mL, theo thứ tự; chất số 6 ức chế sinh trƣởng của A. niger với MIC 40 µg/mL. Ngồi ra các chất số 1-3 và 6 cịn có tính độc đối một số dịng tế bào ung thƣ. Đây là những thông tin đầu tiên về hóa học và sinh học của NNS trên cây H. hainanensis.
- Từ NNS Ampelomyces sp. của cây thuốc Urospermum picroides đã tách đƣợc
14 chất bậc hai, mà hai trong số đó vừa có hoạt tính kháng dịng tế bào L5178Y nhƣ các chất cịn lại, vừa có hoạt tính kháng các vi khuẩn Gram dƣơng gây bệnh [19]. Giá trị MIC của 2 chất này kháng các vi khuẩn Staphylococcus aureus, S. epidermis, và Enterococcus feacalis là 12,5 và 12,5-25 µg/mL, theo thứ tự.
1.3.3. Các chất gây độc tế bào ung thư
Hàng loạt chất gây độc tế bào ung thƣ do nấm nội sinh tổng hợp trong điều kiện lên men đã đƣợc phát hiện. Dƣới đây chúng ta điểm qua một số chất ấy cũng nhƣ các nấm nội sinh đã tổng hợp nên chúng.
1.3.3.1. Taxol
Taxol là một ví dụ điển hình về chất gây độc tế bào ung thƣ do nấm nội sinh tổng hợp, mà trƣớc kia đƣợc cho rằng chỉ do các cây thuộc chi thông đỏ (Taxus) sinh ra [153]. Những NNS tổng hợp taxol đầu tiên đƣợc biết đến chính là NNS của các lồi thơng đỏ, và chúng đã “bắt chƣớc” các cây chủ của mình về mặt hóa sinh học để tổng hợp nên taxol. Một trong số đó là Taxomyces andreanae, và sau đó
đƣợc biết nhiều NNS khác khơng có quan hệ họ hàng với nó cũng có khả năng này, đó là các chi: Pestalotia, Pestalotiopsis, Fusarium, Alternaria, Pithomyces, Monochaetia, v.v. [153]. Với những quan sát về sự có mặt của taxol ở những chi
nấm rất khác nhau và xa nhau nhƣ vậy, các tác giả nhằm đƣa ra một bằng chứng về sự cần thiết phải nghiên cứu NNS và bảo tồn những cây chủ của chúng.
Có thể có 11 lồi thơng đỏ chúng mọc trƣớc hết ở các vùng núi nhiều bóng râm ở bắc bán cầu. Taxol, một thuốc chống ung thƣ quan trọng, đƣợc tìm thấy ở tất cả những lồi thơng đỏ nói trên [153]. Mặc dù taxol đã đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp bán tổng hợp nhƣng vẫn là một thuốc đắt tiền. Nó đƣợc dùng để đặc trị ung thƣ vú và ung thƣ buồng trứng. Bây giờ, taxol đƣợc sản xuất từ VSV mà cũng có năng suất cao nhƣ việc sản xuất các chất kháng sinh từ những nấm khác thì thứ thuốc quí này sẽ rất hữu ích, sẽ rẻ hơn trƣớc kia rất nhiều, và sẽ đƣợc cung cấp rộng rãi.
Chi thông đỏ (Taxus) luôn là một nguồn giàu nấm nội sinh. Taxus brevifolia từ Vƣờn Quốc Gia Glacier, Montana, chứa NNS Taxomyces andreanae; NNS này
là trƣờng hợp đầu tiên đƣợc biết đến nhƣ một nguồn taxol không phải là cây thơng đỏ. Khơng lâu sau đó hàng trăm nấm khác nhau đã đƣợc phân lập từ T. brevifolia và bằng một phƣơng pháp miễn dịch học ngƣời ta biết rằng ít nhất có 10 nấm (chƣa định tên) có khả năng tổng hợp taxol [153]. Ngồi ra, sau đó, khoảng 1995-1996,
hàng trăm loài nấm nội sinh đã đƣợc phân lập từ các cây thông đỏ ở Châu Âu, Châu Á, và Bắc Mỹ. Có thể nói, các cây thơng đỏ là một kho báu chứa nhiều vi sinh vật chƣa từng đƣợc phát hiện và rất đáng chú ý, chúng tƣơng tác với nhau và với cây chủ. Một điều rất đặc biệt là Taxomyces andreanae đã không đƣợc phân lập từ bất
kỳ cây thông đỏ nào ngoài cây nguyên thủy ở Vƣờn Quốc Gia Glacier, Montana. Những nấm đã đƣợc biết là có tổng hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae,
Pestolotiopsis microspora [154]. Ngồi ra, thơng qua những bằng chứng miễn dịch
học, Strobel và cs cũng đã phát hiện đƣợc sự tổng hợp taxol ở nhiều NNS khác phân lập từ cây thông đỏ Taxus brevifolia, bao gồm nhiều chủng của Penicillium sp.,
Pestolotiopsis sp. và Truncatella sp. [153]. Vẫn nhóm tác giả này đã phân lập đƣợc
hơn 160 loài NNS từ Taxus spp. phổ biến ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ, khơng kể
T. brevifolia, trong số đó có ít nhất 7 chủng có khả năng tổng hợp taxol, lƣợng taxol
trong dịch nuôi của chúng dao động từ 95 đến 1081 ng/L; khơng có nấm nào từ T.
floridana hoặc T. canadensis tổng hợp trên 10 ng/L. Các NNS từ T. chinensis
(thông đỏ Châu Á) và T. globosa đã không đƣợc kiểm tra. Tuy nhiên trong một số
trƣờng hợp, các dịch chiết của những nấm này đã cho phản ứng dƣơng tính khi kiểm tra về các taxan khác bằng các kháng thể đơn dòng phản ứng đặc hiệu đối với bộ khung taxan. Điều đó gợi ý rằng trong những nấm này có mặt các dẫn xuất hoặc các tiền chất của taxol, nhƣ baccatin III chẳng hạn.
Về mặt di truyền và tiến hóa, sự tổng hợp taxol của NNS phân lập từ các cây thông đỏ Taxus spp. là rất đáng chú ý: có lẽ đã xảy ra một sự truyền gen theo chiều ngang (horizontal gene transfer) từ Taxus spp. sang các NNS của chúng. Điều đó là rất có thể, bởi sự truyền gen theo kiểu nhƣ vậy đã đƣợc biết rõ giữa các vi khuẩn
Agrrobacterium tumefaciens và A. rhizogenes với các thực vật bậc cao. Có rất ít tài
liệu về sự truyền gen từ một thực vật bậc cao sang một cơ thể nội sinh hoặc cơ thể ký sinh. Mặt khác, dĩ nhiên, theo các tác giả trên đây các NNS có thể có một hệ thống tổng hợp taxol đƣợc tiến hóa một cách độc lập với cây chủ.
Nhiều NNS không phải của các cây thông đỏ cũng có khả năng tổng hợp taxol. Một ví dụ là 9 trong 16 chủng nấm Pestalotiopsis microspora, trong tổng số
25 chủng NNS từ cây bách (Taxodium distichum) ở Nam Carolina, Mỹ. Nhƣ vậy, dƣờng nhƣ các nấm tổng hợp taxol có thể đƣợc tìm thấy khơng chỉ ở các cây thơng đỏ mà còn ở các loài cây khác, những lồi mà cũng địi hỏi các điều kiện môi trƣờng nhƣ các cây thông đỏ [153].
1.3.3.2. Các xanton
Trên lá cây thuốc có tên Croton oblongifolius của Thái Lan, Pornpakakul và
cs đã phân lập đƣợc NNS Emericella variecolor có khả năng tổng hợp bốn xanton
có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ. Bốn xanton này là: samixanton (1), 14- metoxytajixanton-25-axetat (2), tajixanton metanoat (3), và tajixanton hydrat (4). Tất cả 4 chất đều có hoạt tính kháng vừa phải và chọn lọc đối với khối u dạ dày, khối u ruột kết, và khối u vú. Riêng chất số 4 biểu thị hoạt tính gây độc trung bình đối với tất cả các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm (khối u dạ dày, KAT03; khối u ruột kết, SW620; khối u vú, BT474; khối u gan ngƣời, Hep-G2; và khối u phổi, CHAG0). Ngoài ra, trong điều kiện thí nghiệm, thấy rằng các chất số 2 và 4 hầu nhƣ có hoạt tính gây độc khối u dạ dày và khối u vú ngang bằng so với một chất hóa trị liệu, doxorubixin hydroclorit [131].
1.3.3.3. Các chất từ Penicillium sp. nội sinh ở cây Hopea hainanensis
Từ nấm này đã phân lập đƣợc nhiều chất, trong đó các chất: monometylsulocrin (1), axit rhizoctonic (2), asperfumoit (3), và axit 3,5-dicloro-p- anisic (6) có hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào KB với IC50 là 30, 20, 20, 50 µg/mL, theo thứ tự; và đối với dòng tế bào Hep-G2 với IC50 là 30, 25, 15, 10 µg/mL, theo thứ tự. Ngồi ra, các chất số (2), (3) và (6) cịn có hoạt tính kháng một số nấm gây bệnh cho ngƣời [170].
1.3.3.4. Các chất từ nấm Stemphylium globuliferum nội sinh ở cây thuốc Mentha pulegium
altersolanol K (11), altersolanol L (12), stemphypyron (13), và các hợp chất đã biết nhƣ 6-O-metylalaternin (1), macrosporin (2), altersolanol A (3), alterporiol E (6), alterporiol D (7), alterporiol A (8), alterporiol B (9), và altersolanol J (10) [55].
Trong số các chất mới thuộc loại dimer antranoit kiểu alterporiol, hỗn hợp của các chất G và H (4 và 5) có độc tính đáng kể đối với các tế bào L5178Y, với trị số EC50 là 2,7 µg/mL, cịn các chất khác chỉ có hoạt tính yếu. Các chất số 1, 2, 3, và hỗn hợp các chất 4 và 5 biểu thị hoạt tính ức chế kinaza mạnh nhất, với các giá trị EC50 tƣơng ứng 0,64 -1,4 µg/mL.
1.3.3.5. Các chất từ nấm Ampelomyces sp. nội sinh ở cây thuốc Urospermum picroides picroides
Mƣời bốn chất tự nhiên, trong đó có các chất mới, đƣợc tách ra từ nấm nói trên ni trong các mơi trƣờng lỏng và đặc [19]. Từ chất chiết của nấm nuôi trên các môi trƣờng lỏng đã tách đƣợc một pyron (2) và các antraquinon sulfat hóa (7 và 9) cùng với các chất đã biết (1, 3, 6 và 8). Từ chất chiết của nấm ni trên mơi trƣờng đặc thì tách đƣợc các chất 4, 5 và 11 cũng nhƣ các chất đã biết 6, 8, 10, 12, 13, và 14. Các chất 4, 8, và 10 có tính độc mạnh nhất đối với dịng tế bào L5178Y với các trị số EC50 từ 0,2 đến 7,3 µg/mL. Ngồi ra, các chất 8 và 10 cịn biểu thị hoạt tính kháng các vi khuẩn Gram (+) gây bệnh.
Đặc biệt, các chất 6 và 8 đƣợc nhận biết là những hợp phần của một chất chiết từ một mẫu cây chủ khỏe mạnh. Điều này cho thấy việc sản sinh các hoạt chất bởi nấm nội sinh có lẽ cũng có thể xảy ra trong các điều kiện in situ bên trong cây chủ.
1.3.4. Các chất chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hóa đã đƣợc tìm thấy ở hai chất pestaxin và isopestaxin đƣợc tách ra từ nấm nội sinh Pestalotiopsis microspora của cây Terminalia morobensis, một loài thực vật thuộc họ Combretaceae tại hệ thống sông Sepik, New
Guinea [158]. Chất đầu tiên có bản chất là isobenzofurano, còn chất thứ hai - 1,3,dihydro isobenzopuran. Cả hai chất vừa có hoạt tính chống oxy hóa vừa có hoạt tính kháng nấm (Pythium ultimum).
Pestaxin Isopestaxin
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của pestaxin và isopestaxin
Phép đo quang phổ cộng hƣởng điện từ đã chứng tỏ isopestaxin có khả năng làm sạch các gốc peroxit và hydroxyl tự do trong dung dịch. Hoạt tính chống oxi hóa của pestaxin ít nhất mạnh hơn một độ so với trolox, dẫn xuất của vitamin E.
1.3.5. Các chất kháng kí sinh trùng
Kí sinh trùng nguyên sinh động vật thuộc các chi Leishmania và Trypanosoma (bộ Kinetoplastida, họ Tripanosomatidae) thƣờng gặp ở các vùng
nhiệt đới, cận nhiệt đới, và gây những bệnh nghiêm trọng, gây tổn thất nặng nề về kinh tế, xã hội, ảnh hƣởng tới hàng trăm triệu ngƣời.
Những thuốc đang lƣu hành hiện nay để điều trị các bệnh do hai loại kí sinh trùng này đã đƣợc sử dụng từ nhiều thập kỷ nay, nhƣng có những bất cập lớn về hiệu quả, thời lƣợng dùng thuốc, phƣơng thức dùng thuốc, độc tính, và giá thành. Cho đến nay, ngay cả các hãng dƣợc phẩm lớn cũng không đƣa ra đƣợc một loại thuốc mới nào để điều trị những căn bệnh này [164].
Trong khi đó, ngƣời ta biết rõ rằng những vi sinh vật mà có mối tƣơng tác về trao đổi chất với cây thì sinh ra hàng loạt chất trao đổi có cấu trúc mới lạ và có các hoạt tính sinh học đáng chú ý [77, 143, 159]. Thật vậy, một số khả năng chữa bệnh và một số hoạt tính sinh học, lúc đầu đƣợc cho là của các loài cây, nhƣng về sau đƣợc biết là của các chất trao đổi bậc hai do chính vi sinh vật nội sinh thực vật sinh ra [92].
thông qua các thử nghiệm sinh học [39]. Các tác giả đã phân lập đƣợc NNS mà về sau đƣợc định tên là Cochliobolus sp. có quan hệ gần với C. melimidis, từ cây Piptademia adiantoides (Fabaceae). Cây này đƣợc chọn để nghiên cứu về NNS có
các hoạt chất mới vì dịch chiết của nó đã thể hiện hoạt tính trong Chƣơng trình Sàng lọc khu hệ thực vật của Brazil để tìm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính.
Để tìm ra các hoạt chất từ NNS này, các tác giả đã dùng hai thử nghiệm sinh học, một liên quan đến các cá thể kí sinh trùng Leishmania, và một liên quan đến
enzym trypanotion reductaza (TryR) của chúng. Flavoenzym này là một phần của hệ thống enzym phức tạp có mặt ở các động vật nguyên sinh thuộc họ Kinetoplastida, giúp chúng sống sót qua các stress oxy hóa [64]. Điều quan trọng hơn là ở chỗ, TryR là thành phần thiết yếu đối với sinh trƣởng và sự sống sót của các kí sinh trùng này và là đích nhắm tới của thuốc, do đó rất có tác dụng để phát hiện và thiết kế ra các thuốc mới diệt hai loại kí sinh trùng Leishmania và Trypanosoma [64, 65, 68].
Kết quả cho thấy rằng, dịch chiết thô của một NNS trong cây Piptadenia adiantoides có thể giết chết 90% kí sinh trùng Leishmania amozonensis và ức chế
100% sự khử thuốc thử Eblman trong thử nghiệm TryR khi thử ở nồng độ 20 µg/mL. Sau đó họ đã tách đƣợc hai chất, cochlioquinon A và isocochlioquinon A. Trong hai chất này thì chỉ có chất đầu có hoạt tính trong thử nghiệm TryR, nhƣng cả hai đều có tác dụng diệt Leishmania với các trị số EC50 là 1,7 và 4,1 µM, theo thứ tự. Những kết quả này gợi ý rằng, các cochlioquinon có thể đƣợc dùng làm chất khởi đầu để tạo ra các thuốc mới điều trị bệnh do Leishmania, và củng cố quan
điểm cho rằng các NNS là một nguồn quan trọng các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học [39].
Đƣợc biết, các cochlioquinon và các hợp chất tƣơng tự có mặt trong nhiều chi nấm khác nhau, nhƣng những kết quả trên đây của Compos và cs là báo cáo đầu tiên về hoạt tính diệt kí sinh trùng Leishmania của các chất thuộc nhóm chất này
1.3.6. Các chất ức chế miễn dịch
Thuốc ức chế miễn dịch đƣợc sử dụng để tránh việc thải bỏ mô ghép ở các bệnh nhân đƣợc cấy ghép mô.
Trƣớc khi phát hiện ra rằng nấm nội sinh có khả năng sinh ra các chất ức chế miễn dịch thì ngƣời ta đã sử dụng thành cơng xyclosporin trong cấy ghép mơ.
Sau đó từ NNS Fusarium subglutinans của cây Tripterigeum wilfordii đã
tách ra đƣợc chất diterpen pyron subglutinol A và B [105,158]. Cả hai chất này thể hiện hoạt tính với cả tế bào lympho và tế bào tymoxyt thử nghiệm; gây ức chế 50% tế bào bạch cầu thử nghiệm với nồng độ 0,1 µM. Hơn nữa, các subglutinol A và B khơng có độc tính, chính vì vậy cần tiến hành nhiều nghiên cứu sâu hơn để sớm ứng dụng những chất này vào thực tiễn.
1.3.7. Các chất chữa bệnh tiểu đường
Từ các cây ở rừng mƣa nhiệt đới gần Kinshasa, Công-gô, các nhà khoa học đã phân lập đƣợc NNS Pseudomassaria sp. và từ nấm đó tách đƣợc hợp chất L-
783,281. Hợp chất này không chứa peptit và hoạt động giống nhƣ insulin, nhƣng khác insulin ở chỗ nó khơng hề bị phân hủy trong ống tiêu hóa nên có thể uống đƣợc. Khi thử nghiệm cho chuột bị bệnh tiểu đƣờng uống L-783,281 theo liều lƣợng xác định, sau một thời gian lƣợng glucoza trong máu của chúng giảm đi rõ rệt. Những kết quả trên góp phần mở ra một liệu pháp mới để điều trị bệnh tiểu