Cây phân loại của chủng KS14 và các lồi có họ hàng gần

Nhƣ vậy, kết quả định tên 10 chủng nấm có hoạt tính kháng vi sinh vật cao nhất cho thấy, các chủng nấm đều thuộc 3 chi là Trichoderma, Fusarium và Penicillium. Trong đó các lồi thuộc chi Penicillium xuất hiện nhiều nhất (5 chủng),

tiếp theo là Trichoderma (3 chủng) và Fusarium (2 chủng). Nhƣ vậy có thể thấy Trichoderma và đặc biệt là Penicillium là những chủng nấm nội sinh phân lập đƣợc

nhiều nhất. Điều này phù hợp với các nghiên cứu đã đƣợc công bố cho thấy phần lớn các chủng NNS đều thuộc nhóm Ascomycota và Deuteromycota [69,158]. Kết

quả tƣơng tự cũng đƣợc thông báo trong nghiên cứu về các chủng nấm nội sinh trên cây thuốc dân gian của Ấn Độ (Azadirachta indica), rằng các chủng NNS thuộc 3

chi Trichoderma, Penicilium và Pestalotiopsis là những chủng NNS chiếm ƣu thế

[112].

3.4. Hoạt tính sinh học của cặn chiết và của dịch lên men các chủng nấm nội sinh đã đƣợc lựa chọn sinh đã đƣợc lựa chọn

Nấm nội sinh nói chung chứa nhiều sản phẩm trao đổi chất thứ cấp mới có khả năng chữa bệnh [162]. Ngồi ra, những lồi nấm nội sinh hiếm quý với những chất mới có hoạt tính sinh học cao thƣờng đƣợc tìm thấy trên cây thuốc [118, 158]. Hàng loạt chất mới có hoạt tính sinh học đã đƣợc phát hiện từ các lồi NNS trên cây thuốc ở nhiều nƣớc trên thế giới.

Trên cơ sở đó, các chủng nấm nội sinh đã lựa chọn của chúng tôi đƣợc cho lên men để phát hiện các hoạt tính sinh học quý của dịch lên men, để sau đó tách lấy các chất có hoạt tính mong muốn.

10 chủng nấm nội sinh đã lựa chọn đƣợc nuôi 3 tuần trên môi trƣờng khoai tây dịch thể; dịch nuôi của chúng đƣợc dùng để xác định các hoạt tính enzym ngoại bào; đồng thời cặn chiết etylaxetat từ các dịch nuôi này, đƣợc dùng để xác định hoạt tính kháng VSV, hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ và hoạt tính chống oxy hố.

3.4.1. Hoạt tính kháng VSV của các cặn chiết etylaxetat

10 cặn chiết etylaxetat của 10 dịch lên men đƣợc thử hoạt tính kháng 8 loại VSVKĐ trên các phiến vi lƣợng 96 giếng theo phƣơng pháp đƣợc nêu ở phần 2.3.7.1. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.4 cho thấy:

a) Các cặn chiết của cả 3 chủng thuộc chi Trichoderma đều thể hiện hoạt tính kháng rất tốt từ 5 loại VSVKĐ trở lên. Đặc biệt, cặn chiết của chủng T. konilangbra KS14 thể hiện hoạt tính kháng tất cả 8 chủng VSVKĐ bao gồm các chủng vi khuẩn Gram (+), VK Gram (-), nấm men và nấm mốc thử nghiệm, với các giá trị MIC từ 100 đến 200 g/ml. Các kết quả này phù hợp với kết quả sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng nấm nuôi trên môi trƣờng rắn, bằng phƣơng pháp thỏi thạch đã đƣợc ghi ở bảng 3.1. Theo đó, chủng KS14 kháng cả 8 VSVKĐ, với phần lớn các

vòng kháng khuẩn và kháng nấm là lớn hơn rất nhiều so với của tất cả các chủng còn lại.

Điều đặc biệt là cả 3 chủng Trichoderma đều có khả năng kháng hầu hết các nấm mốc kiểm định (tỉ lệ kháng là 5/6 lƣợt thử). Điều này phù hợp với thực tế là một số loài trong chi Trichoderma rất thƣờng đƣợc dùng làm chế phẩm diệt nấm hại trong kiểm soát sinh học dịch bệnh cây trồng để thay thế cho kiểm sốt hóa học trƣớc kia; ngồi ra, các chủng nấm thuộc chi Trichoderma có thể cịn đƣợc sử dụng để chống lại các VSV gây bệnh khác bao gồm vi khuẩn Gram (+), VK Gram (-) và nấm men [163].

b) Về phần các cặn chiết của 5 loài thuộc chi Penicillium, chúng đều có hoạt tính kháng một số vi khuẩn và/hoặc nấm mốc, trong đó cặn chiết từ chủng P. ehrlichii KS15 và P. citrinum KS18 có phổ kháng khuẩn, kháng nấm rộng, kháng 5/8 VSVKĐ. Đƣợc biết trong thực tiễn, nhiều chủng Penicillium đƣợc sử dụng để sản

xuất chất kháng sinh ở qui mô công nghiệp.

c) Cặn chiết từ 2 chủng nấm F. moniliforme KS24 và F. oxysporum KS33 đều biểu hiện hoạt tính kháng 3 trong 8 loại VSVKĐ, chủ yếu kháng vi khuẩn (5 lƣợt thử có hoạt tính kháng vi khuẩn và 1lƣợt thử có hoạt tính kháng nấm A. niger) với các giá trị MIC từ 100 đến 200 g/ml.

Nhƣ vậy, kết quả cho thấy cả 10 cặn chiết etylaxetat của các chủng NNS đều biểu hiện hoạt tính kháng VSVKĐ. Trong đó chủ yếu là hoạt tính kháng khuẩn (27 lƣợt thử dƣơng tính với vi khuẩn, 16 lƣợt thử dƣơng tính với nấm). Hoạt tính kháng nấm thể hiện ở phần lớn các cặn chiết, trong đó hoạt tính kháng nấm mốc A. niger là đáng kể so với hoạt tính kháng các nấm khác (số lƣợt thử có hoạt tính kháng nấm mốc A. niger so với kháng F. oxysporum, S. cerevisiae, C. albicans là 7: 4: 3: 2).

Các kết quả thu đƣợc trên đây có thể liên quan đến một nghiên cứu khác trên cây chủ khổ sâm [6], theo đó cặn chiết metanol của lá cây cho hoạt tính kháng mạnh với cả 2 loại vi khuẩn Gram (-) và VK Gram (+) và với cả nấm mốc: rất có thể, hoạt tính kháng VSV của lá cây khổ sâm trong nghiên cứu này là do các NNS trong cây đó kích thích cây tổng hợp nên, thậm chí do chính các NNS đó tổng hợp nên.

Bảng 3.4. Hoạt tính kháng VSV của cặn chiết etylaxetat từ các chủng NNS lựa chọn

STT Mẫu thử

Nồng độ ức chế tối thiểu đối với VSVKĐ, MIC (g/ml)

Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (+) Nấm mốc Nấm men

E. coli P. aeruginosa B. subtilis S. aureus A. niger F. oxysporum C. albicans S. cerevisiae NNS từ cây khổ sâm 1 T. viride KS6 200 200 200 200 200 200 (-) 200 2 T. konilangbra KS14 100 200 200 100 100 200 200 200 3 P. ehrlichii KS15 200 (-) 200 200 200 200 (-) (-) 4 P. nigricans KS17 (-) (-) 200 (-) 200 (-) (-) 200 5 P. citrinum KS18 200 (-) 200 200 200 200 (-) (-) 6 P. wortmanii KS19 200 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 7 F. moniliforme KS24 100 (-) 200 200 (-) (-) (-) (-) 8 F. oxysporum KS33 200 (-) (-) 200 200 (-) (-) (-) NNS từ cây bùm bụp 9 T. harzianum MB8 200 (-) 200 100 100 (-) 200 (-) 10 P. baarnense MR2 200 (-) 200 200 (-) (-) (-) (-)

3.4.2. Hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thư của các cặn chiết etylaxetat

10 cặn chiết đƣợc dùng để thử hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ: ung thƣ gan (Hep-G2), ung thƣ cơ vân (RD) và ung thƣ phổi (Lu), theo phƣơng pháp đã trình bày ở mục 2.3.7.2. Kết quả thử nghiệm nêu trong bảng 3.5 cho thấy:

a) Trong số các cặn chiết etylaxetat của 3 chủng Trichoderma thì chủng T. viride KS6 không biểu hiện hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ, chủng T. konilangbra KS14 biểu hiện hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thƣ gan với giá trị % tế bào sống sót là 37,6; chủng T. harzianum MB8 có hoạt tính mạnh, gây độc với cả 3 dòng tế bào ung thƣ gan, ung thƣ cơ vân và ung thƣ phổi với giá trị % tế bào sống sót rất thấp là 0; 0; 1,78 theo thứ tự. Nhƣ vậy chủng T. harzianum MB8 này có hoạt tính gây độc cả 3 dòng tế bào ung thƣ khá mạnh, nhƣng vì hoạt tính “quá mạnh” nhƣ vậy nên khó có thể ứng dụng nó để sản xuất thuốc chống ung thƣ.

Thông thƣờng những chất có khả năng gây độc các dòng tế bào ung thƣ nhƣng ở mức độ vừa phải nhƣ của T. konilangbra KS14 hay P. nigricans KS17 thì dễ đƣợc nghiên cứu để sử dụng trong điều trị.

b) Trong số cặn chiết etylaxetat của 5 chủng Penicillium thì chủng P. citrinum KS18 khơng biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào với cả 3 dịng tế bào ung thƣ thử nghiệm, còn lại các chủng P. ehrlichii KS15, P. nigricans KS17, P. wortmanii

KS19 và P. baarnense MR2 đều thể hiện hoạt tính gây độc 2 dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm, với giá trị % tế bào sống sót tƣơng đối thấp.

c) Cả 2 cặn chiết etylaxetat của chủng nấm F. moniliforme KS24và F. oxysporum KS33 đều có hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ. Đặc biệt, chủng F. moniliforme KS24 dƣơng tính với cả 3 dòng tế bào ung thƣ gan, ung thƣ cơ vân và ung thƣ phổi với giá trị % tế bào sống sót thấp là 6,5; 0; 0 theo thứ tự, cịn chủng F.

oxysporum KS33 có hoạt tính gây độc với 1 dòng tế bào ung thƣ gan với % tế bào

Bảng 3.5. Hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ của cặn chiết etylaxetat từ các chủng NNS lựa chọn

ST

T Mẫu thử

Dòng tế bào

CS (Cell survival), % Kết luận

Hep-2 RD Lu Đối chứng (+) 2,5 0,07 1,5 0,6 4,15 0,02 Dƣơng tính Đối chứng (-) 100  0,0 100  0,0 100  0,0 Âm tính NNS từ cây khổ sâm 1 T. viride KS6 93,90,2 93,30,99 72,01,4 Âm tính 2 T. konilangbra KS14 37,61,01 92,82,5 98,11,4 Dƣơng tính 1 dịng 3 P. ehrlichii KS15 00,0 00,0 54,40,3 Dƣơng tính 2 dịng 4 P. nigricans KS17 41,660,7 50,00,8 610,1 Dƣơng tính 2 dịng 5 P. citrinum KS18 78,30,5 90,490,3 88,30,5 Âm tính 6 P. wortmanii KS19 00,0 1,270,2 67,50,5 Dƣơng tính 2 dịng 7 F. moniliforme KS24 6,50,4 00,0 00,0 Dƣơng tính 3 dịng 8 F. oxysporum KS33 21 0,4 91,90,5 69,61,01 Dƣơng tính 1 dòng NNS từ cây bùm bụp 9 T. harzianum MB8 0 0 1,780,1 Dƣơng tính 3 dòng 10 P. baarnense MR2 14,76± 0,2 8,6± 0,65 79,7±1,9 Dƣơng tính 2 dịng

Nhìn chung, các cặn chiết etylaxetat của các chủng NNS đƣợc lựa chọn có hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ, 8 trong 10 cặn chiết có hoạt tính gây độc với ít nhất 1 dòng tế bào thử nghiệm. Phần lớn (8/10) các cặn chiết gây độc với một hoặc cả hai dòng tế bào ung thƣ gan (Hep-G2) và ung thƣ cơ vân (RD), chỉ có 2/10 cặn chiết gây độc với dòng tế bào ung thƣ phổi (Lu). Trong số đó T. konilangbra KS14 và P. nigricans KS17 có hoạt tính gây độc tế bào vừa phải, do đó có thể có triển vọng ứng dụng trong nghiên cứu tìm kiếm thuốc chống ung thƣ.

Những kết quả trên đây có thể gợi ý phần nào về nguyên nhân của các hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ ngƣời (ung thƣ gan, ung thƣ cơ vân…) của các

bào ung thƣ ngƣời của một ditecpenoit tách từ lá cây này [10]: rất có thể các NNS trong cây là nguyên nhân của các hoạt tính ấy; chúng kích thích cây tổng hợp nên các chất có hoạt tính nói trên, hoặc cũng có thể chính chúng tổng hợp nên các hoạt chất ấy.

3.4.3. Hoạt tính chống oxy hố của các cặn chiết etylaxetat

10 cặn chiết etylaxetat thu đƣợc từ dịch lên men của các chủng NNS đƣợc thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH theo phƣơng pháp đã nêu ở mục 2.3.7.3. Bảng 3.6 thể hiện hoạt tính chống oxy hóa của các cặn chiết này, theo đó có thể rút ra mấy nhận xét nhƣ sau:

a) Trong 3 cặn chiết của 3 chủng nấm Trichoderma, chỉ có cặn chiết của

chủng T. konilangbra KS14 có hoạt tính chống oxy hóa, với giá trị SC > 66%. b) Cả 5 cặn chiết của 5 chủng nấm Penicillium đều có hoạt tính chống oxy hóa tốt, với giá trị SC từ 50- 69%.

c) Trong số 2 cặn chiết của 2 chủng Fusarium thì chủng F. moniliforme KS24 có hoạt tính chống oxy hóa với giá trị SC bằng 60%.

Nhƣ vậy có 7 trong 10 cặn chiết etylaxetat đƣợc thử nghiệm có hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH. Điều đó cho thấy các NNS trong cây thuốc nói chung và các chủng đã lựa chọn nói riêng là một nguồn phong phú về các chất chống oxy hóa.

Bảng 3.6. Hoạt tính chống oxy hóa của cặn chiết etylaxetat từ các chủng NNS lựa chọn từ các chủng NNS lựa chọn STT Mẫu thử SC (%) Kết luận Đối chứng (+) 69,05 0,7 Dƣơng tính Đối chứng (-) 0,000,0 Âm tính NNS từ cây khổ sâm 1 T. viride KS6 33,062,4 Âm tính 2 T. konilangbra KS14 66,39±0,05 Dƣơng tính 3 P. ehrlichii KS15 69,00,4 Dƣơng tính 4 P. nigricans KS17 65,460,2 Dƣơng tính 5 P. citrinum KS18 50,210,2 Dƣơng tính 6 P. wortmanii KS19 62,00,4 Dƣơng tính 7 F. moniliforme KS24 600,0 Dƣơng tính 8 F. oxysporum KS33 12,2±0,09 Âm tính NNS từ cây bùm bụp 9 T. harzianum MB8 48,20,5 Âm tính 10 P. baarnense MR2 64±0,05 Dƣơng tính

3.4.4. Hoạt tính enzym ngoại bào của dịch ni các chủng nấm lựa chọn

Các chủng nấm đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoai tây dịch thể, dịch nuôi sau khi loại bỏ sinh khối đƣợc sử dụng để xác định khả năng sinh enzym ngoại bào.

Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.7 cho thấy:

a) Cả 3 chủng Trichoderma đều có ít nhất một hoạt tính enzym ngoại bào,

trong đó chủng T. konilangbra KS14 có khả năng sinh 3 enzym ngoại bào là: proteaza, amylaza và xenlulaza với hoạt tính vào loại lớn nhất trong số các lần đo 6 hoạt tính của 10 chủng (với đƣờng kính vịng phân giải từ 14 đến 23 mm).

c) Cả 2 chủng Fusarium đều biểu hiện khả năng sinh enzym ngoại bào (2 và 3 trên 6 loại enzym).

Nhìn chung, hầu hết các chủng có 2 hoạt tính proteaza và amylaza, một số chủng khác có thêm hoạt tính xenlulaza, một số ít hơn nữa có chitinaza. Tỉ lệ giữa các chủng có hoạt tính proteaza, amylaza, xenlulaza và chitinaza là 8:7:4:2. Khơng phát hiện chủng nào có ligninaza hoặc lipaza.

Bảng 3.7. Hoạt tính enzym của các chủng NNS lựa chọn

ST

T Chủng NNS

Vòng phân hủy cơ chất (D-d, mm) của các chủng NNS lựa chọn Proteaza Amylaza Chitinaza Ligninaza Lipaza Xenlulaza Từ cây khổ sâm 1 T. viride KS6 0 0 7 0 0 0 2 T. konilangbra KS14 23 14 0 0 0 14 3 P. ehrlichii KS15 0 0 0 0 0 0 4 P. nigricans KS17 14 5 0 0 0 5 5 P. citrinum KS18 12 24 0 0 0 27 6 P. wortmanii KS19 23 12 0 0 0 0 7 F. moniliforme KS24 4 10 0 0 0 0 8 F. oxysporum KS33 15 13 0 0 0 24 Từ cây bùm bụp 9 T. harzianum MB8 6 0 10 0 0 0 10 P. baarnense MR2 12 19 0 0 0 0

Nhận xét chung về hoạt tính sinh học từ cặn chiết etylaxtet của 10 chủng nấm nội sinh đƣợc lựa chọn

Từ các bảng 3.4- 3.7 có thể tóm tắt nhƣ sau:

- Cặn chiết etylaxetat từ dịch lên men của cả 10 chủng NNS đều có hoạt tính kháng từ 1đến 8 VSVKĐ, trong đó cặn chiết từ dịch lên men chủng T. konilangbra KS14 có phổ kháng rộng nhất (8/8 VSVKĐ), gồm vi khuẩn Gram (+), Gram (-), nấm men và nấm mốc, với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) từ 100 đến 200g /ml.

Tính vƣợt trội về khả năng kháng VSV của chủng KS14 so với các chủng còn lại là rất phù hợp với kết quả sàng lọc ban đầu bằng phƣơng pháp thỏi thạch (xem bảng 3.1 và 3.2).

- Cặn chiết etylaxetat từ dịch lên men của 8 trong10 chủng NNS có hoạt tính gây độc từ 1đến 3 dịng tế bào ung thƣ thử nghiệm, trong đó chủng T. konilangbra KS14 gây độc tế bào ung thƣ gan và chủng P. nigricans KS17 gây độc 2 dòng tế bào ung thƣ gan và ung thƣ cơ vân với mức độ độc tế bào vừa phải (% tế bào sống sót là 37,60; 41,66 và 50% theo thứ tự. Đó là những mức độ độc tế bào vừa phải so với tỉ lệ này của các chủng khác đối với các dòng tế bào, nhƣ 0; 1,27; 14,76, 21%). Một chất chống ung thƣ với độc tính vừa phải đối với tế bào thƣờng có nhiều triển vọng đƣợc nghiên cứu tiếp để tiến tới ứng dụng trong điều trị.

- Cặn chiết etylaxetat từ dịch lên men của 7 trong 10 chủng NNS lựa chọn có hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH, trong đó chủng T. konilangbra KS14 và chủng P. ehrlichii KS15 có hoạt tính lớn nhất với khả năng bao vây các gốc tự do

(SC %) > 66%.

- 9 trong 10 chủng NNS nói trên có hoạt tính từ 1 đến 3 trong 6 enzym ngoại bào thử nghiệm, trong đó chủng T. konilangbra KS14 có 3 hoạt tính proteaza, amylaza, xenlulaza với hoạt độ enzym cao nhất so với các chủng khác (đƣờng kính vịng phân giải cơ chất đạt từ 14 đến 23mm).

Nhƣ vậy, chủng T. konilangbra KS14 tỏ ra có ƣu thế rõ rệt so với các chủng cịn lại, về tất cả 4 hoạt tính sinh học đƣợc khảo nghiệm.

Điều đặc biệt quan trọng là chủng T. konilangbra KS14 khơng những có hoạt tính sinh học nổi trội hơn 54 chủng NNS còn lại, mà lồi T. konilangbra này cịn

xuất hiện với tần số cao trong quá trình phân lập lặp lại nhiều lần để kiểm chứng kết quả. Hiện tƣợng này gợi ý rằng T. konilangbra có thể là một loài NNS đặc hữu của cây khổ sâm, hoặc ít ra giữa 2 cơ thể có những quan hệ cộng sinh đặc biệt khác các quan hệ cộng sinh khác. Nếu những giả thiết đó đƣợc chứng minh thì sẽ mở ra những vấn đề lý thú về lý thuyết thông qua mối quan hệ này để đi sâu nghiên cứu,