CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp
2.3.5. Tách các chất từ cặn chiết của dịch lên men chủng Trichoderma
Cặn chiết etylaxetat (12 gam) thu đƣợc theo qui trình ở hình 2.3 đƣợc sắc kí trên cột silicagel với hệ dung môi n-hexan/etylaxetat 99:1 và 1:1, thu đƣợc 8 phân đoạn chính. Phân đoạn 1 đƣợc phân tách tiếp bằng sắc kí cột với hệ dung môi n- hexan/ etylaxetat (8:2), sau khi kết tinh thu đƣợc hợp chất KS14-1 (12mg) và hợp chất KS14-5 (15mg). Phân đoạn 4 đƣợc phân tách tiếp bằng sắc kí cột với hệ dung mơi CHCl3- MeOH (20:1), thu đƣợc hợp chất KS14-4 (8mg). Phân đoạn 5 và 6 cũng đƣợc phân tách tiếp bằng sắc kí cột với hệ dung mơi CHCl3- MeOH (9:1) thu
Dịch lên men
Dịch chiết etylaxetat
Cặn chiết etylaxetat Chiết với
etylaxetat 1:1 (3 lần)
Loại bỏ dung môi dƣới áp suất giảm Môi trƣờng nuôi nấm
Lên men (3 tuần)
Qui trình tách các chất từ cặn chiết etylaxetat của dịch lên men chủng
Trichoderma konilangbra KS14 đƣợc trình bày trên hình 2.4.
Hình 2.4. Qui trình tách các chất từ cặn chiết etylaxetat của chủng nấm Trichoderma konilangbra KS14 của chủng nấm Trichoderma konilangbra KS14
2.3.6. Xác định cấu trúc các hợp chất tách được
Các hợp chất đƣợc tách từ cặn chiết etylaxetat của dịch lên men chủng
Trichoderma konilangbra KS14 bằng các phƣơng pháp sắc kí: sắc kí lớp mỏng (TCL), sắc kí lỏng cao áp (HPLC), sắc kí lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS). Đƣợc thực hiện tại Phịng Cơng nghệ Hóa học - Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên.
Cấu trúc hóa học của các hợp chất này đƣợc xác định bằng sự kết hợp các phƣơng pháp phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối ion hoá bụi
Hợp chất KS14-1 (12mg) PĐ8 Cặn chiết EtOAc (12gam) Sắc kí cột; n-hexan: etylaxetat (99:1 – 1:1) PĐ1 PĐ2 PĐ4 PĐ5 PĐ6 Hợp chất KS14-5 (15mg) Hợp chất KS14-4 (8mg) Hợp chất KS14-3 (13mg) Hợp chất KS14-2 (17mg) Sắc kí cột n-hexan: etylaxetat (8:2) Sắc kí cột CHCl3: MeOH (20:1) Sắc kí cột CHCl3: MeOH (9:1) Sắc kí cột CHCl3: MeOH (9:1)
electron (ESI-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton, phổ cộng hƣởng từ cácbon 13, phổ DEPT. Đƣợc thực hiện tại Phịng Phân tích - Viện Hóa học.
2.3.7. Xác định các hoạt tính sinh học của các chủng NNS
2.3.7.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật a) Phương pháp thỏi thạch (đối với khuẩn ty) a) Phương pháp thỏi thạch (đối với khuẩn ty)
Các chủng NNS đƣợc cấy trên môi trƣờng khoai tây. Sau 5-7 ngày, khi sợi nấm mọc tốt thì dùng khoan nút chai đục lấy các thỏi thạch chứa NNS trên bề mặt, đặt chúng vào đĩa petri đã cấy các chủng VSVKĐ. Để các đĩa này trong tủ lạnh 4-5 giờ cho chất kháng sinh khuếch tán vào mơi trƣờng thạch và sau đó đặt vào tủ ấm 370C đối với vi khuẩn, đọc kết quả sau 24 h; tủ ấm 300C đối với nấm và đọc kết quả sau 48 giờ. Hoạt tính kháng VSV đƣợc xác định theo đƣờng kính vịng vơ khuẩn (D-d, mm): D là đƣờng kính vịng vơ khuẩn, d là đƣờng kính thỏi thạch.
b) Phương pháp khoan lỗ thạch (đối với dịch nuôi)
Các chủng NNS đƣợc nuôi trong môi trƣờng khoai tây dịch thể từ 5-7 ngày. Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trƣờng thạch đã cấy các chủng VSV kiểm định trong đĩa petri. Nhỏ dịch nuôi đã loại bỏ khuẩn ty vào các lỗ khoan. Các bƣớc tiếp theo đƣợc tiến hành nhƣ trong phƣơng pháp thỏi thạch.
c) Phương pháp pha loãng liên tục (đối với mẫu chiết)
Hoạt tính kháng vi sinh vật của các mẫu chiết đƣợc tiến hành trên các phiến vi lƣợng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phƣơng pháp pha loãng liên tục của Vanden Bergher và Vlietlinck [165] hiện đang đƣợc áp dụng tại trƣờng Đại học Dƣợc, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Các chủng VSVKĐ đã đƣợc nêu ở phần nguyên liệu 2.1.2.
Phép xác định gồm hai bƣớc nhƣ sau:
Bƣớc1: Sàng lọc sơ bộ tìm mẫu thử có hoạt tính
Chuẩn bị VSVKĐ
Các chủng VSVKĐ đƣợc duy trì trong các mơi trƣờng: thạch thịt - pepton đối với vi khuẩn; Hanxen đối với nấm men, và Czapek - Dox đối với nấm mốc. Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm, các chủng VSVKĐ đƣợc hoạt hóa trong các mơi
trƣờng dinh dƣỡng dịch thể: môi trƣờng Eugon Broth cho vi khuẩn và Mycophyl cho nấm (ủ 24 giờ ở 37°C đối với vi khuẩn, 48 giờ ở 30°C đối với nấm), sau đó pha lỗng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Land (khoảng 108 vi sinh vật/ml).
Chuẩn bị mẫu thử
Hịa tan mẫu thử bằng dung mơi DMSO với nồng độ 8 mg/ml đối với chất thô, 2 mg/ml đối với chất tinh.
Tiến hành thí nghiệm
Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ nhƣ sau: Dãy đối chứng âm 1: môi trƣờng nuôi VSVKĐ.
Dãy đối chứng âm 2: DMSO + huyền dịch VSVKĐ đã đƣợc hoạt hóa. Dãy đối chứng âm 3: huyền dịch VSVKĐ đã đƣợc hoạt hóa.
Dãy đối chứng dƣơng: kháng sinh + huyền dịch VSVKĐ đã đƣợc hoạt hóa. Dãy thí nghiệm: mẫu thử + huyền dịch VSVKĐ đã đƣợc hoạt hóa.
Các kháng sinh của dãy đối chứng dƣơng gồm: ampixilin cho vi khuẩn Gr (+); tetraxilin cho vi khuẩn Gr (-); nystatin hoặc amphoterixin B cho nấm sợi và nấm men. Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp.
Phiến thí nghiệm đƣợc để trong tủ ấm 370C/24h đối với vi khuẩn và 300C/48h đối với nấm.
Đọc kết quả
Giếng có mẫu thử dƣơng tính khi nhìn bằng mắt thƣờng thấy trong suốt, khơng có vi sinh vật sinh trƣởng, giống nhƣ hình ảnh ở các giếng đối chứng âm tính. Mẫu thử dƣơng tính ở bƣớc 1 sẽ đƣợc tiếp tục thử bƣớc 2 để tính giá trị MIC.
Bƣớc 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của mẫu thử dƣơng tính
Chuẩn bị mẫu thử
Các mẫu thử dƣơng tính ở bƣớc 1 đƣợc pha lỗng theo các nồng độ thấp dần, 5-10 nồng độ, để tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ mà ở đó vi sinh vật bị ức chế gần nhƣ hồn tồn.
Tiến hành thí nghiệm
Đọc kết quả
Mẫu có MIC là mẫu mà ở đó khơng có vi sinh vật sinh trƣởng, và khi nuôi lại vi sinh vật ở nồng độ của mẫu này trên môi trƣờng thạch đĩa để kiểm tra thì thu đƣợc giá trị CFU < 5.
Các mẫu thơ có giá trị MIC ≤ 400µg/ml đƣợc coi là có hoạt tính trong các nghiên cứu của chúng tơi.
Các mẫu tinh có giá trị MIC ≤ 100µg/ml đƣợc coi là có hoạt tính trong các nghiên cứu của chúng tơi.
2.3.7.2. Xác định hoạt tính gây độc các dịng tế bào ung thƣ
Nuôi tế bào ung thƣ in vitro theo Skehan và cs [150]. Xác định hoạt tính gây
độc các dịng tế bào ung thƣ theo phƣơng pháp SRB của Likhiwitayawuid và cs
[108] đang đƣợc tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thƣ Quốc gia của Mỹ (NCI). Phƣơng pháp này đã đƣợc phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm 1996.
Phép xác định gồm hai bƣớc nhƣ sau:
Bƣớc 1: Sàng lọc tìm các mẫu thử có hoạt tính Chuẩn bị tế bào
Dịng tế bào đƣợc lƣu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các mơi trƣờng dinh dƣỡng MEME, Eagle hoặc DMEM có bổ sung huyết thanh bê tƣơi 7- 10%.
Tế bào đƣợc nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (CO25%; độ ẩm 98%; nhiệt độ 37o
C, vô trùng tuyệt đối), tế bào đƣợc hoạt hố trƣớc khi thí nghiệm tiến hành từ 18-24 giờ.
Dùng dung dịch tripsin versel 0,1% để tách tế bào sau khi đã rửa tế bào bằng đệm PBS. Pha tế bào bằng môi trƣờng sạch, đếm số lƣợng, tạo huyền dịch tế bào ở nồng độ thí nghiệm (khoảng 3-5x104 tế bào/ml tùy theo từng loại tế bào thử nghiệm).
Hòa tan mẫu thử bằng dung môi DMSO với nồng độ 8 mg/ml đối với chất thô, 2 mg/ml đối với chất tinh.
Tiến hành thí nghiệm
Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ nhƣ sau: Dãy đối chứng âm: DMSO 10%
Dãy đối chứng dƣơng: chất chuẩn có khả năng diệt tế bào, elipitine hoặc colchicine, pha tới nồng độ 0,01mM trong DMSO.
Dãy thí nghiệm: mẫu thử + dịch huyền phù tế bào Phiến đƣợc ủ trong tủ CO2 ở 37oC trong 3 ngày. Kết thúc thí nghiệm
Tế bào sau khi ủ 3 ngày đƣợc cố định bằng dung dịch TCA lạnh. Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit axetic 1% và rửa lại bằng axit axetic 1% để loại màu thừa; để khơ, hồ lại bằng dung dịch đệm Trisbazơ 10M trên máy lắc ngang.
Đọc trên máy ELISA ở bƣớc sóng 495-515mm.
Chú ý: Ln phải có phiến đối chứng cho lƣợng tế bào ở thời điểm bắt đầu thí nghiệm (ngày 0). Phiến đối chứng ngày 0 có chứa dịch huyền phù tế bào trong các giếng, để tủ ấm CO2 ở 37oC trong 30 phút. Cách cố định và nhuộm nhƣ trên.
Tính kết quả
Tính giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì đƣợc đánh giá là có hoạt tính.
Giá trị CS(%) đƣợc tính theo cơng thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn
σ đƣợc tính theo cơng thức:
Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i : giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± ) sẽ đƣợc chọn ra cho thử nghiệm bƣớc 2 để tìm giá trị IC50.
Bƣớc 2: Tìm giá trị IC50
Dùng giá trị CS% của 10 nồng độ, dựa vào chƣơng trình Table curve theo thang giá trị logarit của đƣờng cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50.
Cơng thức:
Trong đó: y: nồng độ chất thử X: Giá trị CS (%)
Các mẫu thơ có giá trị IC50 ≤ 40µg/ml đƣợc coi là có hoạt tính trong các nghiên cứu của chúng tôi.
Các mẫu tinh có giá trị IC50 ≤ 10µg/ml đƣợc coi là có hoạt tính trong các nghiên cứu của chúng tơi.
2.3.7.3. Xác định hoạt tính chống oxy hoá
Theo phƣơng pháp của Shela G. và cs [145].
Nguyên lý
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch etanol bão hoà. Khi cho các mẫu thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu mẫu thử nghiệm có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do thì nó sẽ
làm giảm độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do đó. Hoạt tính chống ơxy hố đƣợc đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bƣớc sóng 515 nm.
Phép xác định gồm hai bƣớc nhƣ sau:
Bƣớc 1: Sàng lọc tìm các mẫu thử có hoạt tính Chuẩn bị mẫu thí nghiệm
Tạo dung dịch có các gốc tự do: DPPH 300 M trong etanol.
Mẫu thử đƣợc pha trong DMSO với nồng độ là 8 mg/ml đối với chất thô, 2 mg/ml đối với chất tinh.
Tiến hành thí nghiệm
Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ nhƣ sau: Dãy đối chứng âm: DMSO 10% + DPPH trong etanol Dãy trắng: mẫu thử + etanol
Dãy đối chứng dƣơng: axit ascobic trong DMSO 10%+ DPPH trong etanol Dãy thí nghiệm: mẫu thử + DPPH trong etanol
Phiến đƣợc bọc kín để tránh ánh sáng môi trƣờng và đặt trong tủ ấm 370C trong 2 giờ.
Đọc kết quả trên máy Elisa, bƣớc sóng 515 nm.
Tính kết quả
Tính giá trị SC% ( % Scavenging capacity). Giá trị SC% đƣợc tính theo cơng thức:
Độ lệch tiêu chuẩn tính theo cơng thức của Ducan nhƣ ở mục 2.3.7.2. Những mẫu có giá trị hoạt động SC% ≥ 50% đƣợc coi là có hoạt tính, sẽ đƣợc chọn ra cho thử nghiệm bƣớc 2 để tìm giá trị SC50.
Bƣớc 2: Tìm giá trị SC50
Pha mẫu thử theo 5 nồng độ, nhỏ mẫu thử vào phiến và tiến hành thí nghiệm nhƣ ở trên, giá trị SC% đƣợc đƣa vào chƣơng trình Table curve, thơng qua
nồng độ mẫu thử và SC% hoạt động của mẫu thử để tính ra nồng độ của mẫu thử nghiệm mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH đƣợc trung hồ bởi chất thử, theo cơng thức:
Trong đó: y- nồng độ chất thử X- Giá trị SC(%)
Các mẫu thơ có giá trị SC50 ≤ 400µg/ml đƣợc coi là có hoạt tính trong các nghiên cứu của chúng tơi.
Các mẫu tinh có giá trị SC50 ≤ 100µg/ml đƣợc coi là có hoạt tính trong các nghiên cứu của chúng tơi.
2.3.7.4. Xác định hoạt tính các enzym ngoại bào
Hoạt tính các enzym xenlulaza, amylaza, proteaza, ligninaza và lipaza đƣợc xác định theo nguyên lý khuếch tán trên thạch, bằng phƣơng pháp khoan lỗ thạch: dịch nuôi nấm đã loại bỏ tế bào (dịch enzym thô) đƣợc đƣa vào các lỗ đục trên đĩa thạch đã chứa các cơ chất tƣơng ứng của các enzym (xem mục 2.2.3). Các đĩa có lỗ thạch chứa dịch enzym thô đƣợc để trong tủ lạnh 3-5h, rồi trong tủ ấm 18-24h, để enzym khuyếch tán và tác dụng với cơ chất. Với xenlulaza, cần làm hiển thị vòng phân hủy bằng lugol trong 15 phút, sau đó rửa bằng nƣớc muối 1N; với amylaza, hiển thị bằng lugol; với proteaza - bằng dung dịch TCA 5%. Với ligninaza và lipaza không cần làm hiển thị. Các vùng phân hủy bởi xenlulaza, amylaza và proteaza là những quầng trong suốt xung quanh lỗ đục, vùng phân hủy bởi ligninaza có màu xanh, bởi lipaza có màu đục trắng. Đƣờng kính của các vùng phân hủy ấy (mm) biểu thị hoạt độ của các enzym của dịch nuôi nấm.
2.3.8. Khảo sát tác dụng của các chế phẩm Trichoderma konilangbra KS14 đối với cây khổ sâm đối với cây khổ sâm
Tạo chế phẩm
- Chủng Trichoderma konilangbra KS14 đƣợc nuôi 3 tuần trên môi trƣờng khoai tây dịch thể. Sau đó tách riêng phần dịch và phần khuẩn ty có chứa bào tử nấm.
- Phần khuẩn ty có chứa bào tử đƣợc nghiền nhỏ, phối trộn với một số chất mang và cơ chất dinh dƣỡng để tạo thành chế phẩm dạng bột.
- Phần dịch thể đƣợc sử dụng trực tiếp nhƣ chế phẩm dạng lỏng.
Đối tượng thử nghiệm chế phẩm
Các chế phẩm đƣợc thử nghiệm trên 60 cành chiết từ cây khổ sâm trồng ở Vƣờn Thuốc Cổ Nhuế.
Thử nghiệm chế phẩm
- 60 cành chiết đƣợc chia làm 3 lơ thí nghiệm, trong đó có 1 lơ khơng sử dụng chế phẩm (lơ đối chứng), kí hiệu C; 1 lô bổ sung chế phẩm dạng lỏng vào bầu đất quanh cành chiết, kí hiệu T1, và 1 lơ bổ sung chế phẩm dạng bột vào bầu đất, kí hiệu T2. Tất cả các bầu chiết đƣợc chăm sóc và theo dõi sự phát triển trong cùng điều kiện.
- Mẫu cây đƣợc lấy về phân tích hàm lƣợng nhóm chất ent-kauran sau 3 tháng theo dõi.
Xác định hàm lượng nhóm chất ent-kauran từ các mẫu cành chiết
Các mẫu cành chiết đƣợc thu hoạch sau 3 tháng theo dõi. Các mẫu này đƣợc rửa sạch, cắt nhỏ, sau đó đƣợc sấy khơ ở 30-400C, đƣợc xay nhỏ, sau đó đƣợc chiết bằng metanol, thu đƣợc các cặn chiết metanol tổng.
Các cặn chiết metanol này đƣợc chạy máy LC-MS (sắc kí lỏng ghép nối khối phổ) với các điều kiện chuẩn (dựa vào phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn các ent- kauran): cột phân tích Zorbax SB-C18, RP (3,0 x 150 mm), hệ dung môi CH3OH: H2O (gradient 10:90), tốc độ dòng 0,4 ml/phút, thời gian ghi 30 phút.
Phân tích các dữ liệu thu đƣợc và so sánh với dữ liệu về cấu trúc, thời gian lƣu mẫu và đặc tính lí học của các crotokin để xác định hàm lƣợng nhóm chất ent- kauran của các mẫu phân tích [117].
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập nấm nội sinh từ cây thuốc
3.1.1. Các chủng nấm nội sinh từ cây khổ sâm
Từ các bộ phận khác nhau của cây khổ sâm (lá, thân và cành, bầu rễ, quả), chúng tôi đã phân lập đƣợc 31 chủng nấm nội sinh, ghi ký hiệu từ KS1 đến KS33, với các đặc điểm nhƣ sau:
Màu sắc khuẩn lạc: Các chủng nấm sau khi phân lập và làm sạch, đƣợc nuôi
trên môi trƣờng thạch khoai tây để quan sát các đặc điểm hình thái, màu sắc của khuẩn lạc cũng nhƣ sắc tố sinh ra trong môi trƣờng và để phân nhóm nấm theo màu sắc khuẩn lạc. Kết quả phân lập nấm và phân nhóm theo màu sắc đƣợc nêu trong hình 3.1 và phụ lục 2.
Kết quả nêu trong hình 3.1 cho thấy: Màu sắc khuẩn lạc của 31 chủng nấm phân lập đƣợc có tính đa dạng khơng cao, chỉ tập trung vào 4 nhóm là trắng, đen, xanh lá cây và vàng nâu. Trong đó nhiều nhất là các chủng có khuẩn lạc màu trắng (11chủng), tiếp theo là màu đen (9 chủng), màu xanh (7chủng) và ít nhất là màu