I. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU A Mục tiêu tổng quát.
2. Xác định tần suất bệnh nhân bệnh nặng có gen C/C13910, là nguyên nhân kém dung nạp lactose do di truyền.
kém dung nạp lactose do di truyền.
II. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Thời gian tiến hành: từ 1/11/2013-30/7/2015 2. Vật liệu
Mẫu sử dụng trong nghiên cứu
- Mẫu máu của bệnh nhân trên 18 tuổi đang điều trị tại khoa săn sóc đặc biệt (ICU) bệnh viện Nhân dân Gia Định – Thành phố Hồ Chí Minh.
- Mẫu amplicon: là các mẫu DNA nhân tạo , dài 330 bp - từ nucleotide 26471 đến nucleotide 26800 - mô phỏng vùng gene MCM6 của SNP LCT- 13910.
AmpC: amplicon mang base “C” tại nucleotide 26638. AmpT: amplicon base “T” tại nucleotide 26638.
GTAAGCATTTGAGTGTAGTTGTTAGACGGAGACGATCACGTCATAGTT TATAGAGTGCATAAAGACGTAAGTTACCATTTAATACCTTTCATTCAG GAAAAATGTACTTAGACCCTACAATGTACTAGTAGGCCTCTGCGCTG GCAATACAGATAAGATAATGTAGC/TCCCTGGCCTCAAAGGAACTCTC CTCCTTAGGTTGCATTTGTATAATGTTTGATTTTTAGATTGTTCTTTGA GCCCTGCATTCCACGAGGATAGGTCAGTGGGTATTAACGAGGTAAAA GGGGAGTAGTACGAAAGGGCATTCAAGCGTCCCATCTTCGCTTCAAC CAAAGCAGCCCTGCTTTTTCCTAGTTTTATTAATAGGTTTGATGTAA
42
Các cặp mồi và mẫu dò sử dụng trong nghiên cứ u
Các cặp mồi và mẫu dò được tổng hợp bởi công ty IDT (Intergrated DNA Technologies, Mỹ) và được bảo quản trong dung dịch đệm TE 1X ở nhiệt độ - 200C. Trình tự và thơng tin của các mồi và mẫu dò được thể hiện trong bảng 2.1.
Bảng 2. 1. Thơng tin trình tự các mồi và mẫu dị
Tên Trình tự nucleotide Kích thƣớc sản phẩm (bp) Vùng gene bắt cặp Nguồn gốc Primer / Probe IC
f-IC 5’- CTC TAT GGG AAG GAC CAG CAG GAG-3’
192
Glutathione – S
Huan Huang (2006)
r-IC 5’- CAA GCC ACC TGA GGG GTA AGG -3’
Probe IC
5’- HEX – CCT GCA GAG TTC CAA AGG GAG TTC CAA AGG AG -3’ Primer LCT-RFLP f-LCT- RFLP primer 5’ - GCT GGC AAT ACA GAT AAG ATA
ATG GAG 3’ 201 MCM6 Kuchay (2011) r-LCT-
RFLP 5’-CTG CTT TGG TTG AAG CGA AGA T-3’
Primer Giải trình tự
Lac3f 5’- CAA TGT ACT AGT AGG CCT CTG C -3’
163 MCM6 Tự thiết kế
Lac3 r 5’- CGT TAA TAC CCA CTG AC -3’
Probe As PCR (sử du ̣ng chung cho các mix dùng kỹ thuâ ̣t real -time As PCR)
Probe LCT-As
5’ - FAM CTG GCC TCA AAG GAA CTC TCC AAG GAA CTC TCC
TCC - 3’ MCM6 Tự thiết kế
f-Primer As-PCR (dướ i đây là danh sách các mồi xuôi dùng kỹ thuật real -time As-PCR, mồi ngược dùng chung là Lac3r)
Ka-f(C) 5’ - AAT ACA GAT AAG ATA ATG TTGC -
3’ 143
MCM6
Thiết kế theo phương pháp Kambara (2004)
Ka-f(T) 5’ - AAT ACA GAT AAG ATA ATG TTGT -
43
Hóa chất
Hóa chất tách chiết
Hóa chất tách chiết cột Solgent: SolGent Genomic DNA Prep Kit.
Hóa chất tách chiết tủa : RBC 1X, Trizol, chloroform, isopropanol, Ethanol 70, Tris-EDTA (TE) (Khoa Thương).
Hóa chất tách chiết cột : RBC 1X, guanidine HCl, isopropanol, Guanidine hydrochloride – Ethanol, Ethanol 70, Tris-EDTA (TE), Sodium dodecyl sµlfate (SDS) 10%, cợt silica, Proteinase K 10 mg/ml (Khoa Thương).
Hóa chất PCR, RFLP
Hóa chất PCR: DnaFreeTM
2X Mµltiplex PCR Smart Mix (Solgent). Hóa chất real-time PCR: AptaTaq DNA Master Optimization Kit (Roche). Enzyme HinfI (Promega).
Hóa chất điện di
Agarose 2% (Merck).
Thang điện di 100bp (Solgent).
TAE 1X (Tris Acetate EDTA, pH 8,3), dịch nạp mẫu (Khoa Thương).
Hóa chất tạo dòng
Chủng vi khuẩn dùng để dòng hoá: Escherichia coli DH5 (Promega) (F–,
ø80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rK–,
mK+), phoA, supE44, λ–, thi-1, gyrA96, relA1).
Vector tạo dòng: pBluescript II SK (+) (Stratagene) có kích thước 2961 bp và có cấu trúc g ồm các vùng gene : f1 (IG): Rep (pMB1): đóng vai trò khởi đầu sao chép, Bla (ApR): mã hóa beta lactamase có vai trị kháng Ampiciline, lacZ: mã
hóa cho tiểu phần beta galactosidase cho phép sàng lọc khuẩn lạc xanh trắng, mµlti cloning sites (MCS): chứa các vị trí của enzyme cắt giới hạn, trong đó có enzyme Sma I (hình 2.1). được sử dụng để mở vòng plasmid tạo mạch thẳng với hai đầu bằng.
Hình 2.1. Cấu trúc pBluescript II SK (+)
Hóa chất tạo dịng: CaCl2 100mM (Merck), SmaI (Promega), T4 DNA ligase
44
Môi trường Luria-Bertani (LB): 10g NaCl, 10g bacto tryptone, 5g cao nấm men, hòa tan trong H2O, chỉnh pH 7, thêm nước cho đủ 1l. Hấp khử trùng ở 121°C trong 30 phút
Môi trường thạch LB-Ampicillin: môi trường LB bổ sung agar 15g/l, Ampicillin để đạt nồng độ cuối 100 µg/ml.
Thiết bi ̣, vật tư tiêu hao và phần mềm chuyên dụng
Vật dụng tiêu hao (găng tay không phấn, ống eppendorf 1,5 và 2,0 ml, đầu tip dùng cho micropipettes có phin lọc).
Micropipettes các loa ̣i 10 l, 100 l, 1000 l (mLine BioHit).
Máy Real-time PCR (Mx3000P – Statagene và CFX 96 - BioRad) và h ệ thống máy vi tính.
Máy ly tâm eppendorf (Z322M - Hermle) và máy lắc trộn (SA8 - Stuart). Bồn ủ nhiệt khô (SBH130 – Stuart).
Hê ̣ thống điê ̣n di (Bio-Rad) và bàn soi gel (UVP). Tủ lạnh 4oC và tủ đông - 20oC.
Phần mềm chuyên dụng: Clustal X 1,8, AnnHyb 4,9, NCBI, AlleleID 7,0