So sánh hai phƣơng pháp PCR-RFLP và real-time As-PCR

I. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU A Mục tiêu tổng quát.

5. So sánh hai phƣơng pháp PCR-RFLP và real-time As-PCR

Chúng tơi so sánh quy trình real -time As-PCR với quy trình PCR -RFLP để xác đi ̣nh khả năng sử du ̣n g quy trình real-time As-PCR trong viê ̣c xác định kiểu SNP LCT-13910

Thí nghiệm được tiến hành trên mẫu máu toàn phần lấy từ 30 bê ̣nh nhân chưa đươ ̣c xác đi ̣nh SNP LCT-13910. Mỗi mẫu máu được tách chiết theo phương pháp tách chiết cột . Dịch DNA ly giải được pha loãng 100 lần và được sử dụng làm bản mẫu thực hiện hai phản ứng.

 Mô ̣t phản ứng PCR-RFLP.

 Mô ̣t că ̣p phản ứng real-time As-PCR.

Kết quả xét nghiê ̣m 30 mẫu máu sử du ̣ng phương pháp PCR-RFLP được thể hiê ̣n dưới hình 2.10 sau

Hình 2.10. Kết quả điê ̣n di 30 mẫu máu dùng phương pháp PCR-RFLP

Trong đó từ 1 đến 30 là số thứ tự các mẫu, C là mẫu pAmpC, T là mẫu pAmpT, L là thang 100bp

Như vâ ̣y trong 30 mẫu máu thử nghiê ̣m bằng phương pháp PCR -RFLP, hai mẫu số 28 và 29 có kiểu SNP LCT-13910 CT. Hai mươi tám mẫu còn la ̣i có kiểu SNP LCT-13910 CC.

Kết quả xét nghiê ̣m 30 mẫu máu sử du ̣ng phương pháp real -time As-PCR được thể hiê ̣n dưới da ̣ng giá trị Ct-MCM6 như bảng 2.8.

61

Bảng 2.8. Kết quả xác đi ̣nh SNP LCT -13910 trên 30 mẫu máu sử dụng phương pháp real-time As-PCR

Số thƣ́ tƣ̣ Mix C Mix T Kiểu SNP Số thƣ́ tƣ̣ Mix C Mix T Kiểu SNP 1 28,54 34,78 CC 16 28,72 N/A CC 2 27,48 34,86 CC 17 28,93 N/A CC 3 28,23 N/A CC 18 28,58 34,63 CC 4 28,53 34,57 CC 19 28,62 N/A CC 5 28,64 N/A CC 20 28,99 N/A CC 6 28,29 34,28 CC 21 29,03 N/A CC 7 28,33 34,33 CC 22 28,50 N/A CC 8 28,70 N/A CC 23 28,71 N/A CC 9 28,73 N/A CC 24 29,09 N/A CC 10 27,86 34,54 CC 25 29,13 N/A CC 11 28,42 34,44 CC 26 28,77 N/A CC 12 28,79 N/A CC 27 28,81 N/A CC 13 28,83 N/A CC 28 29,01 29,54 CT 14 28,48 N/A CC 29 29,23 29,63 CT 15 28,52 34,56 CC 30 28,87 N/A CC Như vâ ̣y trong 30 mẫu máu thử nghiê ̣m bằng phương pháp real-time As-PCR, hai mẫu số 28 và 29 có kiểu SNP LCT-13910 CT. Hai mươi tám mẫu còn la ̣i có kiểu SNP LCT-13910 CC. Kết quả giải trình tự 13 mẫu cho kết quả tương đồng . Kết quả xác định SNP của 30 mẫu máu đươ ̣c thể hiê ̣n trong bảng 2.9

Bảng 2.9. Kết quả xác định SNP trên 30 mẫu máu

Phƣơng pháp PCR-RFLP Kiểu SNP TT CT CC Phƣơng pháp Real- time As- PCR TT 0/ 30 0/ 30 0/ 30 CT 0/ 30 2/ 30 0/ 30 CC 0/ 30 0/ 30 28/ 30

Phương pháp real-time As-PCR cho kết quả xác định SNP LCT -13910 trên toàn bô ̣ 30 mẫu máu giống như PCR-RFLP. Đồng thời , phương pháp real -time As- PCR có ưu điểm thờ i gian thực hiê ̣n ngắn hơn, ít các khâu thao tác hơn, không sử dụng enzyme cắt giới hạn , hạn chế ngoại nhiễm do không cần thực hiện điện di . Như vâ ̣y , phương pháp r eal-time As-PCR được sử du ̣ng để thực hiện xác định SNP LCT-13910 về sau.

62