Áp dụng phƣơng pháp real-time AsPCR trên mẫu thƣ̣c đi ̣a

I. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU A Mục tiêu tổng quát.

6. Áp dụng phƣơng pháp real-time AsPCR trên mẫu thƣ̣c đi ̣a

Chúng tôi tiếp tu ̣c áp du ̣ng phương pháp real -time As -PCR để xác định SNP LCT-13910 trên 395 bệnh nhân . Kết quả cụ thể của từng bệnh nhân được trình bày dưới da ̣ng kiểu SNP LCT -13910 như trong phu ̣ lu ̣c 1. Số liê ̣u t hống kê tỉ lê ̣ kiểu SNP LCT -13910 trên tổng 425 bê ̣nh nhân (phụ lục 7) được trình bày trong bảng 2.10.

Bảng 2.10. Bảng thống kê tỉ lê ̣ kiểu SNP LCT-13910 trên 425 bê ̣nh nhân

Kiểu SNP TT CT CC Tỉ lệ 0/ 425 0% 9/ 425 2,12% 416/ 425 97,88 %

Theo nghiên cứ u của Ehrenpreis năm 2007, tỉ lệ người trưởng thành mắc hô ̣i chứng kém dung nạp lactose ở vùng Đông Nam Á là 95-100% dân số

(Ehrenpreis 2007). Như vậy, tỉ lệ trung bình người trưởng thành mắc hô ̣i chứng này là 97,5% dân số. Chúng tôi tiến hành kiểm đi ̣nh giả thuyết tỉ lệ người trưởng thành mắc hội chứng kém dung nạp lactose do yế u tố di truyền trong quần thể bê ̣nh nhân đang điều tri ̣ ta ̣i bê ̣nh viê ̣n Nhân dân Gia Đi ̣nh - thành phố Hồ Chí Minh (ký hiệu là P ) có phù hợp vớ i tỉ lệ người trưởng thành mắc hô ̣i chứng kém dung na ̣p lactose ở khu vực Đông Nam Á (ký hiệu là Po) vớ i đô ̣ tin câ ̣y 95%. Ta có P = 0,9788, P0 = 0,9750, n = 425, mứ c ý nghĩa α = 1-0,95 = 0,05. Theo tính toán, Zα = 1,96 và Z = 0,5018. Như vậy, Z < Zα. Điều này cho phép chúng tôi xác nhâ ̣n giả thuyết đề ra với độ tin câ ̣y 95%.

Tỉ lệ bệnh nhân kém dung nạp lactose ở Việt Nam tương tự như các nước thuô ̣c khu vực Đông Nam Á như Thái Lan 95% (Ehrenpreis 2007) và cao hơn vớ i các nước/ khu vực khác trên thế giới , đă ̣c biê ̣t khu vực châu Âu (trừ khu v ực Địa Trung Hải ) như Caribbean 81,4% (Mendoza 2010), Italia 70% (Monica 2006),

Estonia 24,8% (Lember M 2006), Ba Lan 31,5% (Madry E 2010).

IV. KẾT LUẬN

1) Xây dựng đươ ̣c quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu thu DNA bằng phương pháp tách chiết cột.

2) Tạo được 02 dòng chứng dương pAmpT và pAmpC.

3) Xây dựng đươ ̣c quy trình PCR-RFLP phân biê ̣t SNP LCT-13910.

4) Xây dựng được quy trình Real -time As-PCR phân biê ̣t SNP LCT -13910 với công thức mix Lac-AsPCR (1X AptaTaq DNA Master Optimization Kit, 0,2 mM primer IC (xuôi và ngươ ̣c), 0,1 mM probe IC, 0,2 mM mồi xuôi f-Primer As-PCR, 0,2 mM Lac3r, 0,1 mM probe LCT -As, 5 µl bản mẫu , nước cất vừa đủ 25 µl) và chương trình ln nhiê ̣t Lac-AsPCR: 1 chu kỳ 95o

C - 15 phút, 35 chu kỳ (95oC - 20 giây, 60oC - 40 giây, 72oC - 30 giây, đọc màu HEX và FAM).

5) Phương pháp real-time As-PCR cho kết quả tương đồng 100% với phương pháp PCR-RFLP.

63

6) Áp dụng phương pháp real -time As-PCR để xác đi ̣nh SNP LCT-13910 cho 425 mẫu bằng phương pháp real-time As-PCR. Kết quả tỉ lệ người trường thành mắc hội chứng kém dung nạp lactose trong quần thể phù hợp với số liê ̣u khu vực Đông Nam Á (đô ̣ tin câ ̣y 95%) là 97,88 %.

64

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3